2.3.7.4. Manejo del Material Transplantado

Manejo de las plantas después del transplante inicial

Con la utilización de métodos, como el de Sistema de Inmersión Temporal, ahora es posible producir un número muy grande de plantas, en períodos cortos de tiempo, por lo que existe la necesidad de generar metodologías de manejo que permitan recuperar y mantener las plantas en buenas condiciones hasta que son llevadas al campo.

Esta fase empieza a partir del momento en que las plantas, debidamente acondicionadas, son colocadas en la casa de malla. A partir de allí, los pasos sugeridos son los siguientes:

a. Al octavo día de tener las plantas en la casa de malla se retira el amarre de la bolsa plástica, permitiendo a las plántulas que se vayan adaptando al micro ambiente de las instalaciones.

b. Riego: Si las condiciones son normales y no hay marchites fisiológica, se hace el segundo riego de mantenimiento a los 10 ó 12 días después del transplante. Este segundo riego (10 cm3 por planta) va acompañado con una mezcla de fertilizante rico en fósforo para continuar estimulando el desarrollo de las raíces. Dependiendo de las condiciones micro-climáticas que se tienen en la casa de malla y del estado de turgencia de las plántulas, se puede programar uno o dos riegos diariamente.

c. Riego automático en casa de malla: Cuando el número de plantas sobrepasa las 1.500, se justifica el riego por microaspersión, que debe estar controlado por un reloj y una válvula solenoide. Cuando se utiliza este sistema de riego se deben realizar inspecciones rigurosas para detectar cualquier problema fitopatológico.

d. Fertilización: Cada ocho días se realiza la fertilización con un abono rico en fósforo, alternándolo con un fertilizante completo que contenga los elementos mayores y menores. Si se presentan síntomas puntuales de la deficiencia de un elemento se puede realizar una fertilización foliar con fertilizantes simples o completos.

e. Segundo transplante: Cuando las plántulas tengan entre 45 y 60 días del primer transplante es necesario realizar un nuevo transplante a bolsas plásticas con una capacidad de 500 gramos de suelo, en el que se puede adicionar micorrizas, si se considera necesario, según los análisis del suelo en el que las plantas van a ser sembradas definitivamente.

f. Transplante al sitio definitivo: Entre los 2 y 3 meses de permanecer en la casa de malla, las plantas están listas para ser llevadas al sitio definitivo. Durante este período es importante estar atento a deficiencias nutricionales o problemas de plagas y enfermedades.

Fuente: http://www.sian.info.ve/porcinos/eventos/clayuca0102/fenavi.htm

2.3.7.3. Transplante y Adaptacion Bajo Condiciones de Invernadero

Las plántulas entre 4 y 5 cm obtenidas in vitro una vez que desarrollaron sus raíces y se han alongado, se traslada a un invernadero, procurando realizar esta actividad por la mañana para no dañarlas por el calor. Ya dentro del invernadero, la preaclimatización consistió en que los frascos se destaparan, dejándose bajo malla sombra durante 48 horas, con la finalidad de que las plantas comenzaran a adaptarse acondiciones diferentes a las existentes en el laboratorio donde estaban a temperatura promedio de 26 ± 2 ºc y fotoperiodo de 10 horas luz (lámparas de luz blanca fría fluorescente, con intensidad lumínica de 2000 lux) y 14 horas de oscuridad. Antes de transplantar, se elimina completamente el medio de cultivo de las raíces, para ello se colocaran las plántulas en un recipiente con agua limpia y el medio se eliminara de las raíces manualmente sin dañar a las plántulas. Con la finalidad de evitar contaminación por enfermedades fungosas, las plántulas se sumer durante cinco minutos en un recipiente que contenga una solución preparada con fungicida. Para el trasplante se utiliza un sustrato el cual se esteriliza.

Fuente: http://www.mag.go.cr/rev_meso/v20n01_011.pdf

2.3.7.2. Desinfección o Esterilización del Sustrato

Existen dos formas básicas de esterilizar un sustrato, la olla express, y al baño maría. Recomiendo siempre usar olla express, ya que además de reducir los tiempos de esterilización es mucho más efectiva, sobre todo con los sustratos de grano entero.

-Baño María: Desde mi punto de vista lo mejor para utilizar este sistema es con el método PF. Tiempo de esterilización a partir de hora y media

-Olla express: Es el método más efectivo y más extendido. Existen multitud de ollas express, pero el funcionamiento será igual para todas. Habrá que poner algo en el fondo de la olla para que los vasos o tarros no reciban demasiado calor directo y se nos estallen a las primeras de cambio. Valdrá desde un escurridor metálico, hasta un paño de cocina(con trapos de este tipo lo mejor es asegurarse de que va suficiente agua, ya que no seriamos los primeros(me incluyo) que se quema el trapo dentro de la olla.

Consistirá en meter los vasos, añadiéndole 3cm de agua más o menos. Es algo bastante subjetivo, ya que depende del tamaño de olla, vasos, etc. Aunque el agua medie los vasos no pasará nada, pero más creo que podría ser arriesgado. Una vez dentro se cerrará la olla y se pondrá a fuego vivo hasta que llegue a una presión de (15 psi = 1 atm en presión atmosférica = 1000 gr/cm2) En mi caso mi olla no tiene medidor de presión, por lo que una vez que empiece a salir vapor de agua ya llegará a dicha situación. En este momento reduciremos el fuego y dejaremos esterilizar desde 1hora hasta hora y media(para centeno y alpiste creo que es lo mejor). Existe una forma muy visual de saber si la presión de dentro de la olla es la óptima, y esto es echar una gota de agua en la superficie de la olla cuando ya está esterilizando y ver lo que sucede. Si la gota de agua empieza a burbujear y se evapora rápidamente, se estará haciendo bien.

En todo momento deberá realizarse un riguroso control fitosanitario empleándose antibióticos, fungicidas e insecticidas de uso universal.

Fuente: http://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&ved=0CCUQFjAB&url=http%3A%2F%2Fes.scribd.com%2Fdoc%2F27303866%2FMANUAL-CULTIVO-DE-HONGOS-ALUCINOGENOS&ei=SJaQUIOSM--42QXD0ID4CA&usg=AFQjCNHTPs5Vn4ZitwzzdC-J-gj0lrOsxw&sig2=poKcZrmz254Azy2bhxrTyw

2.3.7.1. Tipos de Sustrato

Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la elección del substrato, siendo el adecuado aquel que permita el normal crecimiento y desarrollo de las raíces. Se puede emplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaución de realizar una esterilización previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, sea a través del substrato (fertilizantes de liberación controlada) o bien mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); empleándose proporciones ricas en fósforo (N-P-K: 9-45-15) y potasio (N-P-K: 4-25-35) que favorecerán el desarrollo radicular y la rustificación de las plantas.

Fuente: http://www.argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Parte_I.pdf

2.3.7. Transplante al Sustrato

Consiste en realizar el trasplante del medio de cultivo a un sustrato para su maduración. Si el sistema radical fue diferenciado in vitro las plantas no se pueden trasplantar directamente a las condiciones de invernadero sin una paulatina adaptación a las condiciones de suelo. A este periodo de adaptación se le ha denominado periodo de endurecimiento. 

Con especies leñosas, anuales y suculentas, las plantas obtenidas in vitro se deben lavar cuidadosamente para eliminar todos los residuos de agar, que puedan ser una fuente de contaminación. Posteriormente, se trasplantan a recipientes con suelo estéril y se cubren con bolsas de polietileno, que van perforando gradualmente hasta que queden eliminadas completamente en un periodo de 15 a 20; esto se hace con el objetivo de adaptar paulatinamente las plantas a las condiciones de invernadero. Durante esta fase de endurecimiento las plantas se riegan preferentemente con medio de cultivo diluido al 50% y posteriormente se sustituye esta formula de riego por soluciones nutritivas menos complejas. 

Fuente: http://max017.blogspot.mx/2012_04_01_archive.html

2.3.6.4. Preadaptacion y Transplante

El éxito en el proceso de “endurecimiento” depende de muchos factores que deben manejarse en una forma integral, desde la recepción de las vitro-plantas hasta el transplante en el sitio definitivo.

a.- Recepción de vitro-plantas: En las condiciones en que se implementó el proyecto, las plantas generadas en el SIT fueron acondicionadas en frascos con un número de cinco plantas por frasco y transportadas en cajas con capacidad para 90 a 100 frascos, es decir, entre 450 a 500 plantas por caja. Cuando llegaron las cajas con los respectivos frascos se procedió a retirarlos rápidamente de las cajas y ubicarlos en forma separada en un lugar fresco y con iluminación adecuada. Esta es una oportunidad para realizar una preselección, eliminando frascos que están contaminados, quebrados o maltratados.

b.- Pre-adaptación de plántulas: En algunas ocasiones, el número de plantas recibidas de una sola vez fue muy alto y la capacidad disponible de mano de obra no permitió una manipulación rápida del material, debiendo permanecer varios días en las cajas. En estas condiciones se observó una tasa de mortalidad alta. Cuando esto sucede, se recomienda guardar los frascos en un lugar fresco y con luz adecuada, durante 1 ó 2 días. En este período se retira la cinta plástica que rodea la tapa de los frascos para aclimatar la plántula a las condiciones del lugar. Se aconseja que todo el proceso del transplante se inicie a partir de las 4:00 p.m., todos los días, con el fin de evitar la deshidratación de las plántulas, especialmente si el trabajo se realiza en una casa de malla.

c.- Substrato para el transplante: Los mejores resultados que se obtuvieron en el proyecto, en cuanto al sustrato a usar para el endurecimiento, fueron con la mezcla de 1 parte de suelo molido o zarandeado (capa arable no arcillosa) y tres partes de arena (arena gruesa lavada).

En todos los casos, el sustrato fue esterilizado a vapor para minimizar riesgos de presencia de hongos y nematodos del suelo. En caso de que no se cuente con el equipo de “esterilización” se puede depositar la arena en una caneca metálica que contenga agua y, posteriormente, someterla a calor. Respecto del suelo, se puede extender una delgada capa de suelo en un plástico, cubrirla con otro plástico negro en forma hermética y dejarla una semana expuesta al sol.

Fuente: http://www.sian.info.ve/porcinos/eventos/clayuca0102/fenavi.htm

2.3.6.3. Enraizamiento

Cambios anatómicos durante formación de raíces

• Dediferenciación:

     Formación de nuevos sitios meristemáticos

     Marcado por división anticlinal

• Divisiones celulares iniciales:

    Grupos de células sin polaridad, simétricas, no determinadas

•  Divisiones laterales para formar meristema radical determinado:

   1500 células, simetría bilateral

• Crecimiento y emergencia (división y alargamiento):

    Unión vascular con tallo Raíz es visible

Cambios fisiológicos durante formación de raíces

•  Iniciación día 0 a día 3:

l Divisiones anticlinales en periciclo

l Depende de AIA del ápice de raíz primaria

•  Emergencia: día 3 a día 10:

l Salida de raíces

l Requiere de fuente diferente de auxina (ápice y hojas jóvenes)

l Duplica la concentración en forma de pulso (alta conc/corto tiempo)

l No ocurre si se decapita planta, si al adicionar auxina

• Independencia:

l Crecimiento de raíz

l Independiente de auxina de ápice y de raíz primaria

Causas para variabilidad de enraizamiento

• Condiciones ambientales y de nutrición de la planta y de los esquejes
• Manejo de los explantes luego de su separación de la planta madre
• Concentración, método de aplicación y tipo de sustancia reguladora
• Interacción entre sustancias RC
• Edad de los esquejes

Fuente:http://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=4&cad=rja&ved=0CDUQFjAD&url=http%3A%2F%2Ffranciscosaborio.files.wordpress.com%2F2012%2F08%2Fenraizamiento.ppt&ei=SZ6MUL2sAuqfyQHz4IGwAw&usg=AFQjCNFhzpaZCF4_JXpAUvZPpk0Er-12Mw&sig2=QiZoJd-M6F2-fRdaMeZtKw

2.3.6.2. Crecimiento de Yemas Adventicias

La iniciación directa principia con células de parenquima que están situadas ya sea en la epidermis o justo abajo de la superficie del tallo; algunas de esas células se vuelve meristemoides las cuales aparentemente se originan de células individuales, sin embargo, la respuesta de los explantes depende de la concentración de hormonas El desarrollo indirecto de brotes adventicios implica, primero la iniciación de callo basal de los brotes separados en cultivos, Los brotes se originan en la periferia del callo e inicialmente no están conectados al tejido vascular del explante, de manera similar, en plantas intactas, si se aplica citoquinina en bloques de agar cilíndrico pueden originarse de brotes del callo formado en el ápice de epicotilos decapitados. En general la formación de brotes adventicios puede conducir a tasas muy elevadas de multiplicación, mas altas que los que se obtienen de ramas axilares. Por otra parte, los brotes adventicios pueden aumentar las tasas de producción de plantas aberrantes, resultantes de la partición de quimeras que en algunos cultivares resulta en la perdida de la variegacion y en reversiones a una condición más juvenil, cuando se use este sistema las plantas producidas deben evaluarse cuidadosamente respecto a la posible variación. Las diferentes plantas pueden responder en un modo distinto a las diversas citoquininas y auxinas a parte debido a su control hormonal natural. Una secuencia apropiada de hormonas es de importancia particular en cuanto que una hormona puede tener un efecto inductor pero debe estar ausente o en cantidad reducida para que crezca el órgano.

Fuente:http://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=9&cad=rja&ved=0CFcQFjAI&url=http%3A%2F%2Fwww.lamolina.edu.pe%2Fagronomia%2Fdhorticultura%2Fhtml%2Fpropagacion%2Ffitohormonas%2Fshuamanyauri.doc&ei=E5uMUJnFIcygqQHI1oCgBw&usg=AFQjCNEzB_pIJA0zWl8nAyQxzGVB6wFsog&sig2=dW4aiX5MiBKV2OwN0kLAYQ

2.3.6.1. Formación de callo

La característica general del crecimiento de callos, abarca una compleja relación entre el material usado para iniciar los callos, la composición del medio, y las condiciones experimentales durante el período de incubación. Algunos desarrollos de callos son fuertemente lignificados y duros en textura, los que no se pueden separar fácilmente en pequeños fragmentos. Por el contrario los callos frágiles se separan fácilmente y se los denomina cultivos friables, frágiles (“frieble cultures”). Los callos pueden ser amarillentos, blancos, verdes, o coloreados con antocianinas. La pigmentación será en todo el callo, o en algunas regiones sin pigmentar. Su anatomía, es de variación considerable a lo largo de la diferenciación celular.

Los primeros estudiosos asumieron que el cultivo de callos derivados de órganos que contienen clorofila, podrán ser autotróficos en su nutrición. Los callos con clorofila, de cualquier manera, son dependientes de azúcar exógeno para continuar creciendo, aún con adecuada intensidad de luz (Dodd y Lorin, 1982). 

Después que el callo ha crecido asociado al tejido original por un tiempo, se vuelve necesario pasarlo a un medio fresco. El crecimiento en un mismo medio por un período extenso, provocará el agotamiento de nutrientes y una desecación gradual del agar por la pérdida del agua. Los metabolitos secretados por los callos, se pueden acumular en niveles tóxicos en el medio. La transferencia del fragmento del callo debe ser suficiente para asegurar el nuevo crecimiento en el medio fresco. Si el inóculo transferido es muy pequeño, va a exhibir una tasa de crecimiento muy baja, o no va a crecer. Algunos autores (Dodd y Lorin, 1982) recomiendan que el inóculo debe tener 5-10 mm de diámetro y pesar 20-100 mg. Los repiques sucesivos se realizan cada 28 días en tubos de cultivo que tienen 30 cm3 de medio. El tiempo entre repiques es variable y depende de la tasa de crecimiento del callo.

Fuente: http://www.fca.uner.edu.ar/academicas/deptos/catedras/fisiologiaveg/m_didactico/manual_practicas/BDesarrolloED.pdf

2.3.6. Cambios Fisiologicos en el Explante

Los cambios fisiológicos dependen mucho de las condiciones en que se encuentre la planta, y se expresa como un cambio de comportamiento ocasionado por las condiciones de cultivo; estos cambios ocurren con frecuencia, y son revestidos cuando el cultivo se vuelve a poner en las condiciones originales, algunos de los cambios que sufren las plantas al ser sometidas a diferentes condicion son:

• La cuticula es mas delgada
• La epidermis se encuentra desorganizado y separado, lo que ocasiona mayor perdida de agua a traves de ella.
• El parenquima es ineficiente, realiza poca fotosintesis.
• Los estomas no cierran al 100%  y dejan escapar agua.

Fuente: Apuntes tomados en clase

2.3.5.4. Humedad Relativa

Humedad relativa:

Los cuartos de cultivo vegetal deben permanecer controlados con aproximadamente un 70% de humedad relativa (Montoya 1991).

Fuente: http://natalymosquera.blogspot.mx/

2.3.5.3. Temperatura

Temperatura: (28ºC)

Las temperaturas pueden variar de plantas a plantas. Se afirma que los tejidos de plantas tropicales puede esperarse mejor crecimiento a temperaturas mayores que las apropiadas para el cultivo de tejidos de plantas de zonas templadas (Montoya 1991).

En general en cultivo de tejidos se utilizan temperaturas que oscilan entre 24ºC y 28ºC (Montoya 1991).

Es importante además recordar la relación de la temperatura con eventos tales como la morfogénesis y las concentraciones y acción de los reguladores de crecimiento (Montoya 1991).

Fuente: http://natalymosquera.blogspot.mx/

2.3.5.2. Intensidad Luminica

La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los organismos autótrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en los cultivos in vitro. Los aspectos aspectos relacionados con la luz que son importantes en los cultivos in vitro son:

• · La cantidad de luz: LA IRRADIACIÓN . La irradiancia puede ser expresada en función      de la energía por unidad de superficie W/m2
• · La calidad de la luz: EL ESPECTRO (λ) Los tubos fluorescentes son las fuente de luz más usada en las cámaras de cultivo.

Fuente: http://www.biol.unlp.edu.ar/biologiavegetal/seminario05-2012.pdf

2.3.5.1. Fotoperiodo

Luz: Fotoperiodo (8-10 horas).

La longitud de onda y la intensidad lumínica deben ser tenidos en cuenta cuando se realiza el cultivo de tejidos (Montoya 1991).

La alternancia de luz y oscuridad debe ser estudiada en cada caso, a pesar de que en cultivo de tejidos, puede presentarse un requisito de fotoperiodo similar a las plantas crecidas extra vitro. Se ha demostrado en algunas plantas que la longitud del día influye los niveles endógenos de auxinas y citoquininas (Montoya 1991).

De forma análoga, el número de horas de luz que recibe el explanto cultivado in vitro puede afectar a su desarrollo. En general, el mejor fotoperiodo in vivo será también el mejor fotoperiodo in vitro. En general se utiliza luz blanca y un fotoperiodo de 16hs de luz y 8 hs de oscuridad. 

Fuente: http://www.biol.unlp.edu.ar/biologiavegetal/seminario05-2012.pdf
             http://natalymosquera.blogspot.mx/

2.3.5. Condiciones de Incubacion

Los factores físicos juegan un papel determinante para el desarrollo del explante; la luz y la temperatura han sido los factores mas extensamente estudiados. La temperatura de incubación para la propagación de la mayoría de las familias fluctúa entre los 24 y 28°C. Se han variado los regímenes de temperatura en el día y en la noche, y se han encontrado que únicamente en un residuo número de especies tal variación es ventajosa (Chee et al., 1982).

Recientes investigaciones han probado que la luz en un factor fundamental en la morfogénesis (Villalobos et al., 1984). Al respecto se ha observado, en el caso de Pinus radiata, que la luz interacciona con una Citocinina durante la diferenciación de los brotes adventicios y que la morfogénesis no ocurre cuando falta uno de esos dos componentes. El papel de la luz en la diferenciación involucra varios componentes como son la intensidad, el fotoperiodo y la calidad: aunque se reconoce la importancia morfogenética de estos componentes, los estudios realizados con el fin de analizarlos son escasos.

                              

Fuente: http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo6.pdf

2.3.4.3. Siembra de Diferentes Medio: Sólidos y Liquiidos

Los medios para la siembra aparte de los ingredientes para su desarrollo como son; nutrientes orgánicos, fuente de carbono, fuente de nitrógeno, vitaminas, reguladores de crecimiento etc. se agregan sustancias inertes solo para la posición y mejor desarrollo del explante. se agrega phytagel, o bien agar para solidificar lo. antiguamente se utilizaban medios líquidos como extractos o complejos orgánicos, como son el agua de coco, extracto de levadura etc.

La consistencia del medio de cultivo puede emplearse como semisólido o líquido. El agente gelificante más empleado en el cultivo in vitro es el agar extraído de diversas algas marinas. Las diferentes calidades existentes en el mercado modifican la expresión morfogénica debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chinensis, cultivadas en una solución de MS con el agregado de 0,1 mg.L -1 de AIA + 1 mg.L -1 de BAP, donde se observó una respuesta morfogénica diversa según el tipo de agar seleccionado. Por ejemplo, cuando el gelificante empleado fue Chubut-agar, de producción nacional, se observó una gran diferenciación de yemas adventicias, mientras que con el agregado de agar SIGMA R sólo se indujo la proliferación de callo. En caso de seleccionar medios de cultivo líquidos, la respuesta morfogénica observada varía de manera considerable. El cultivo líquido es imprescindible cuando se busca promover la morfogénesis indirecta a través de suspensiones celulares. Para ello es necesario cultivar los callos en medio líquido con agitación para permitir que las células se disgreguen y puedan diferenciar raíces, brotes o embriones somáticos en forma aislada. La selección del medio de cultivo líquido o sólido depende, además, de la especie empleada. En Cymbidium spp, por ejemplo, se ha observado que el empleo de medio de cultivo líquido promueve una mayor diferenciación de protocormos respecto del mismo medio gelificado. A su vez, este proceso puede mantenerse durante varios subcultivos mientras que en medio de cultivo gelificado se observó que los protocormos tienden a formar tallos.

Fuente: http://www.biblioteca.org.ar/libros/150404.pdf

2.3.4.2. Disección del Explante

Cultivar los explantes en una cámara de transferencia con aire estéril («gabinete de flujo laminar»), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el área del aire estéril. Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminación, porque es recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabón y se des infecten con etanol al 70 %. La utilización de guardapolvos, guantes y máscaras protectoras de la boca y de la nariz, así como los gorros protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminación. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cápsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser usados, se deben flamear cuidadosamente en la llama de un mechero. También es necesario flamear la boca de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y después de cultivar el explante. Incubar los cultivos en cámaras o cuartos de cultivo, cerrados, libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulación de personas, y los recipientes con cultivos contaminados deben ser rápidamente eliminados de este sector. Es conveniente que antes del lavado, estos cultivos sean esterilizados.

Fuente: http://www.argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Parte_I.pdf

2.3.4.1. Desinfección del Explante

Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo. Protocolo del tipo de esterilización superficial de material vegetal son:

• Lavado con agua corriente durante 20-30min
• Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.
• Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%. soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2 ), entre el 0,01 y 0,05%.
• Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces).
• En el caso del HgCl2 , el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar.

Fuente: http://www.biol.unlp.edu.ar/biologiavegetal/seminario05-2012.pdf

2.3.4. Siembra del Explante

Una vez seleccionado el mejor explante se requiere desinfectarlo superficialmente para que en el medio de cultivo no crezcan microrganismos (hongos, bacterias) que compitan con el explante. Para esta desinfección se han empleado diferentes compuestos, siendo los mas comunes el las soluciones de hipoclorito de sodio y calcio, el peróxido de hidrogeno, el nitrato de planta, el cloro comercial, el alcohol a diferentes porcentajes, y otros. La selección y concentración del desinfectante y el tiempo de desinfección se determinan en gran medida por las características del explante; en la práctica se establecen principalmente por ensayo y error. 

Después de desinfectar el explante se siembra en el medio de cultivo con ayuda las pinzas procurando no introducir la mano al frasco y que la yema quede hacia a riba, después de esto se cierra y se sella el frasco. 

El explante debe responder eficientemente bajo condiciones in vitro. Es importante considerar el hecho de que el aislamiento de un tejido u órgano del resto de la planta provoca un estado de estrés que altera su metabolismo celular y en forma importante su balance hormonal. Un buen explante es aquella cuyas células sobreviven en una alta porción, a la descomposición antes señalada, y que luego responde eficientemente a las condiciones in vitro.

                                          

Fuente: http://pastns27.blogspot.mx/2012/04/233-explante-234-siembra-del-explante.html

2.3.3.3. Tamaño del explante

En general, cuanto más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la proliferación de callos o la regeneración directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. También es necesario tener en cuenta que existe un tamaño mínimo del explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fácil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeños suelen requerir del empleo de medios más complejos o de los denominados medios acondicionados.

                                             

Fuente: http://www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r87195.PDF

2.3.3.2. Posicion del explante en la planta

En algunas planta cualquier segmento de un órgano cualquiera tienen aproximadamente la misma capacidad regenerativa. Si existen diferencias, pueden ser explicadas generalmente por el hecho de que en la hoja (o tallo), hay tejidos de diferentes edades. Por otro lado, también se han encontrado grandes diferencias, según las zonas, en capacidad de regeneración de algunos órganos.

                                 

Fuente: http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Manual%20c%20in%20v.pdf

2.3.3.1. Tipos de Explante

Pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard 1999). El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son mas bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.

                                   

Fuente: http://cultivodevegetales.blogspot.mx/2010/09/explantes.html

2.3.3. Explante

Se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta, que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces, pétalos, etc.), un órgano (semillas, anteras, ovarios, botones florales, hojas y raíces completas, etc.), estructuras como las anteras y los ovarios, o bien células individuales (como en el caso de los protoplastos). Con excepción de los óvulos y el polen, los explantes están constituidos por tejidos y/o células somáticos. El nombre “explante” es una versión castellanizada del vocablo inglés “explant”; acuñado especialmente para identificar a los tejidos vegetales cultivados in vitro y sin otro significado. La selección del explante es un aspecto clave para tener éxito en el cultivo de tejidos, ya que dependiendo de su ubicación en la planta, del tipo de tejido que contiene, de su edad cronológica y fisiológica, de su contenido endógeno de hormonas, entre otros, se comportará de una manera o de otra.

Fuente: http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Manual%20c%20in%20v.pdf

2.3.2.5. Edad del Órgano del Tejido Vegetal

Este es un aspecto de gran influencia en la morfogénesis. Como regla general se puede decir que cuando más joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor será su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagación de plantas leñosas, la edad del explante es un factor crítico. Si los tejidos son jóvenes, la micropropagación tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas dadoras de explantes.

Fuente: http://www.biblioteca.org.ar/libros/150405.pdf

2.3.2.4. Condiciones de Crecimiento de la Planta

Los cultivos de tejidos vegetales deben mantenerse en condiciones ambientales semejantes a las naturales más favorables. La luz, la temperatura y la humedad relativa son los principales factores del ambiente que inciden sobre los cultivos. El comportamiento de muchos cultivos depende de la calidad, intensidad y fotoperíodo de la luz que reciben, dado que varias enzimas involucradas en el desarrollo y en el metabolismo secundario son influenciadas por la luz. La mayoría de los cultivos desarrollan a una intensidad luminosa entre 5 a 25 W/m 2 (1000 a 5000 lux). Si bien la calidad de la luz puede determinar diferentes respuestas morfogénicas, en general se utiliza luz blanca, pobre en longitudes de onda larga.

El fotoperíodo habitualmente utilizado es de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, aunque algunos cultivos requieren oscuridad. La temperatura de las cámaras de cultivo se regula en general entre 22 y 28°C, permitiendo así el desarrollo tanto de especies de climas templados como de plantas tropicales. Es de destacar que durante el período iluminado, la temperatura en el interior de los frascos de cultivo es 1-2°C superior a la de la cámara, debido al efecto invernadero; se crea así un termoperíodo suave. La velocidad de síntesis y de degradación de distintos compuestos y por ende el nivel de producción y acumulación de metabolitos también es influenciado por la temperatura. En cuanto a la humedad relativa, ésta se mantiene en alrededor del 70 % en las condiciones en las que se realizan habitualmente los cultivos, aunque varía con la temperatura de la cámara y el tipo y cierre de los recipientes. El porcentaje de humedad relativa no es reportado en la mayoría de los trabajos sobre cultivo in vitro de vegetales.

                              

Fuente:http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/2211/4_-_Cultivo_in_vitro.pdf?sequence=6

2.3.2.3. Edad de la Planta

La edad es un factor importante ya que los tejidos juveniles poseen un alto grado de actividad meristematica y tienden a tener mas plasticidad in vitro que los adultos, como es el caso de la respuesta de cotiledones, hipocótilos y hojas aisladas de material juvenil que son usadas para micropropagacion. Los tejidos juveniles presentan una mayor capacidad morfogenetica, la cual se manifiesta en respuesta de crecimiento, proliferación y enraizamiento, a diferencia de un tejido maduro el cual es mas difícil de desdiferenciar e inducir a la producción de raíces y brotes.

Gran parte del éxito de cultivo de tejidos, esta en la edad del explante que va a ser utilizado para los trabajos. La edad de la planta y el grado de diferenciación del tejido, muchas veces son están interrelacionados, y pueden producir efectos interactivos cundo se cultiva in vitro.

Por ejemplo, según los experimentos realizados por Toivonen ty Kartha, en 1988, quienes trabajaron con Pinus glauca, descubrieron que las plantulas a las que se les extirpo los cotiledones 7 a 8 días luego de ser plantadas, formaban las primeras yemas adventicias antes que plantulas cuyas yemas fueron extirpadas luego de los 8 días. Así también la producción de yemas adventicias en explantes de hojas de Cucumis melo, mostraron mayor producción en los explantes que tenian un a tamaño entre 0.3 y 0.5mm los cuales tenían 14 días de plantados. Esta propiedad no tenían aquellos explantes que tenían mas de 21 días.

La edad del explante pude clasificarse en cuatro clases:

• Edad del órgano o de la planta desde que ha sido extraída: Es la edad biológica de la planta, es el tiempo que ha transcurrido desde que la planta comenzó como retoño o como embrión.

• Edad fisiológica o ontogenética: O fase de crecimiento. Incluye los conceptos de juvenilidad y adulto.

• El grado de diferenciación: Con este concepto, las partes mas jóvenes de la planta son células meristemáticas no diferenciadas. Teóricamente se dice que algunas plantas poseen las células meristematicas siempre en estado juvenil y que podrían vivir para siempre.

• Periodo de cultivo: Es el tiempo desde que recién se instala el cultivo.

Fuente: http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis48.pdf

2.3.2.2. Fitosanidad

La planta que se va a utilizar para la propagacion in vitro deben de encontrarse libres de plagas virus o enfermedades para asi obtener plantas sanas. ademas de que se deben buscar plantas que se encuentren en estado vegetativo .

Es muy común la utilización del cultivo de tejidos para la obtención de plantas libres de virus. El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares.

Para evitar y/o minimizar las contaminaciones de los cultivos con microorganismos es necesario:

1. Conocer el material vegetal con que se trabaja y los posibles contaminantes especí- ficos.

2. Realizar una adecuada preparación de la planta dadora de explantes, cultivándola preferentemente en invernaderos tratadas con productos químicos que eliminen patógenos y eventuales microorganismos endófitos.

3. Proceder a la desinfección superficial de los explantes mediante el uso de compuestos químicos con el objeto de eliminar los microorganismos con el menor daño posible para el explante. Si bien no es posible recomendar un procedimiento general, se puede señalar que el procedimiento más popularizado consiste en una doble desinfección mediante la inmersión de los explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante. Algunos procedimientos se basan en el empleo de únicamente etanol o de hipoclorito de sodio. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estéril.

                                    

Fuente: http://www.biblioteca.org.ar/libros/150405.pdf

2.3.2.1. Genotipo

El genotipo es uno de los factores más influyentes en la regeneración in vitro ya que, existen grandes diferencias en la división celular y la capacidad regenerativa en plantas provenientes de una misma especie, como lo observa SWARTZ (1991), quien considera que la respuesta morfogenética de los brotes regenerados, está fuertemente influenciada por el genotipo, ya que algunos explantes provenientes de diferentes individuos parentales presentaban una variación en su desarrollo con las mismas concentraciones hormonales.

                     

Fuente: http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis48.pdf

2.3.2. Selección de Plantas Madres

Un planta madre es aquella a partir de la cual vamos a obtener esquejes, es decir plantas hijas.

La correcta elección y preparación del explanto incide directamente sobre la calidad del mismo y su respuesta frente a los dos principales problemas que afectan al establecimiento del cultivo, que son la contaminación con microorganismos y la oxidación del explanto. Los factores que influyen sobre la calidad del explanto son: el tipo de órgano que sirve como explanto, la edad ontogénica y fisiológica del mismo, la estación en la cual se colecta el material vegetal, el tamaño y el estado sanitario general de la planta donante.

La planta donante debe elegirse en base a una selección masal positiva para las características agronómicas deseables. Una vez seleccionados los individuos, es preciso definir el tipo de explanto a establecer en condiciones in vitro. En general, los órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. El empleo de explantos que se encuentran expuestos a bajos niveles de patógenos puede resolver el problema de la contaminación por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro. Se recomienda colectar explantos primarios a campo durante la estación primaveral y estival, cuando existe una brotación activa de las yemas, ya que el empleo de yemas en estado de dormición ocasiona serios problemas de contaminación. A fin de lograr explantos de óptima calidad es conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo mínimo en condiciones de invernáculo. De esta forma es posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos mediante el control de la intensidad lumínica, temperatura y reguladores de crecimiento. Para especies ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes en condiciones de alta temperatura (25ºC) y baja humedad relativa (75%) a fin de reducir la proliferación de patógenos

Los procesos morfogénicos de floración, dormición y bulbificación son controlados por el fotoperíodo y la temperatura. Controlando estos factores también es posible obtener plantas donantes y explantos más homogéneos durante todo el año. Pueden aplicarse además pretratamientos con reguladores de crecimiento a las plantas donantes, así como también a los explantos mismos. En especies leñosas suele utilizarse como pretratamiento la inmersión de los explantos primarios en soluciones con citocininas a fin de inducir la brotación de yemas.

Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada. Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

                                 

Fuente: http://www.inia.org.uy/publicaciones/documentos/lb/ad/2004/ad_382.pdf

                  http://www.argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Parte_IV.pdf

2.3.1.4. Adaptacion

Las plantas pueden adaptarse bien y lograr buena calidad cuando tienen entre 3–5 cm. Conociendo los gastos que se generan en esta fase se puede ahorrar recursos si las plantas son extraídas con el tamaño adecuado y se aclimatan mejor cuando se mantienen 45 días bajo las condiciones climáticas del territorio. Castro et al. (2002), para Musa, plantearon que la obtención de brotes mayores de 6 cm implicó plantas de muy buena calidad en fase de aclimatización, lo que condujo a una supervivencia superior al 95.5%.

Lo anterior concuerda con lo referido por Suárez (1997) en cuanto a la organización de la producción en las biofábricas cubanas en áreas de aclimatización, donde son admisibles valores entre 95–98% de sobrevivencia para esta fase. Tales resultados coinciden con los de Pérez et al. (1998) que recomiendan que el manejo de las plantas en esta fase debe ser gradual y sin crear traumas, si se quiere obtener plantas de calidad y homogeneidad suficiente para ser llevadas a campo. En este período ocurren la mayor cantidad de pérdidas y, según el cultivo, posterior a los 30 días se puede lograr sobrevivencias superiores al 90%.

                          

Fuente:http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1027-152X2009000400004

2.3.1.3. Enraizamiento

Enrizamiento: se busca la formación de raíces con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.

                                               

Fuente: http://fisiovegetal2011.blogspot.mx/2011/06/propagacion-de-plantas-por-cultivo-in.html

2.3.1.2. Multiplicacion

Multiplicación: esto es para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.

El objetivo principal de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicación sucesivos (subcultivos) y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa de producción.

                            

Fuente: http://es.wikipedia.org/wiki/Micropropagaci%C3%B3n

2.3.1.1. Establecimiento Aseptico

Consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán ventajosamente con el explanto

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

Es el establecimiento aséptico de tejidos vegetales,con un propósito determinado:

• Limpieza  de virus y otros patógenos.

• Multiplicación clonal masiva.

• Resistencia a plagas y enfermedades.

• Resistencia a la toxicidad y otras condiciones ambientales adversas.

• Intercambio y la conservación de germoplasma.

Fuente: http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo6.pdf

2.3.1. Etapas del Cultivo de Tejidos

Pasos necesarios para generar plantas a partir de explantos aislados.

Fuente: http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf

2.3. Establecimiento del Cultivo de Tejidos

El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denominará explanto, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas. 

La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido des diferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales.

El éxito en la propagación de una planta dependerá de la posibilidad de expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. A tal fin, debe inducirse primero la des diferenciación y luego la rediferenciación celular. Un proceso de este tipo sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias, o cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana (ver figura 1) opeperonias mediante porciones de hojas. Uno de los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada es la composición del medio de cultivo. 

El establecimiento consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán ventajosamente con el explanto.

Fuente: http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf

Tarea: Ensayo del Premio Nobel de Medicina 2012

Resumen

Gurdon y Yamanaka (2012) descubrieron que “las células maduras pueden ser reprogramadas a células pluripotenciales”. Este anuncio, esperado por la comunidad científica en los años recientes, ofrece oportunidad para hacer una serie de reflexiones que son de particular importancia para la sociedad actual en que vivimos.

Gamba Ayala (2012) opinó que las células pluripotenciales o “Stem cells” son originalmente las células que fuimos todos nosotros durante la etapa embrionaria. Son células que tienen la capacidad de diferenciarse en diversos tipos de células adultas. Así, de un solo óvulo fecundado, es decir, de una sola célula, eventualmente se genera un individuo que tiene todo tipo de células maduras, especializadas, como neuronas, hepatocitos, fibroblastos, células pancreáticas, miocitos cardiacos, etcétera. Muchas enfermedades resultan por la mortalidad o el malfuncionamiento de células adultas, como varios tipos de cáncer, o por ejemplo, la muerte de miocitos cardiacos después de un infarto, o la mala regulación/producción de ciertos neurotransmisores, como en el caso de los ganglios basales en la enfermedad del Parkinson. Por esto, la idea de generar nuevas células maduras, especializadas, que puedan suplantar a las que se murieron o enfermaron, promete ser una terapia útil para diversos padecimientos. Sin embargo, para poder siquiera pensar en esta posibilidad, lo primero que necesitamos tener en las manos son las células pluripotenciales.

Gurdon y Yamanaka (2012) demostraron que al manipular unos cuantos genes es posible tomar una célula especializada de adulto e inducirla a convertirse en una célula pluripotencial. A estas células las llamaron células pluripotenciales inducibles (iPS). Así, tomaron fibroblastos de un ratón adulto y los convirtieron en iPS. Por lo tanto, a partir de entonces se abrió la posibilidad hacia el futuro de tomar células especializadas de un adulto, por ejemplo, de la piel de un paciente que sufrió un infarto, convertirlas en pluripotenciales y posteriormente derivarlas a formar las células que se necesitan para regenerar el miocardio de ese paciente. De esta forma, ya no se requieren embriones y se elimina el problema de rechazo, porque las células vienen del mismo paciente.

Opinión

Al leer el articulo sobre el Premio Nobel de Medicina a cerca de las células madre pluripontenciales inducidas entendí que las células adultas pueden ser reprogramadas y convertirse en células madre pluripotenciales o también llamadas células madre pluripotenciales inducidas (iPS). Estas células están presentes en la etapa embrionaria, y tienen la capacidad de diferenciarse en diversos tipos de células adultas. Así, de un solo óvulo fecundado, es decir, de una sola célula, eventualmente se genera un individuo que tiene todo tipo de células maduras especializadas, como neuronas, hepatocitos, fibroblastos, etcétera. Ya que muchas enfermedades son causadas por la mortalidad o el malfuncionamiento de células adultas, por ejemplo el cáncer y la enfermedad del Parkinson, la idea de generar nuevas células maduras especializadas, que puedan suplantar a las que se murieron o enfermaron, promete ser una terapia útil para diversos padecimientos. 
En 1962, John B. Gurdon,196 demostró que el núcleo de una célula adulta, especializada, todavía conserva la información para ser pluripotencial, pero que en el medio en que vive, ésta se encuentra apagada. Esto lo demostró al cambiar el núcleo de un ovocito de rana, por el núcleo de una célula del intestino y mostrar que el óvulo con el nuevo núcleo -del intestino- podía producir un renacuajo y eventualmente una rana adulta. En otras palabras, el núcleo de la célula del intestino todavía “recordaba” cómo ser pluripotencial, sólo había que ponerla en el medio adecuado. Por otro lado, en el 2006, Shinya Yamanaka y su grupo demostraron que al manipular unos cuantos genes es posible tomar una célula especializada de adulto e inducirla a convertirse en una célula pluripotencial. A estas células las llamaron iPS; así tomaron fibroblastos de un ratón adulto y los convirtieron en iPS. Por lo tanto, a partir de estos dos hallazgos, se abrió la posibilidad hacia el futuro de tomar células especializadas de un adulto, y posteriormente derivarlas a formar las células que se necesitan para regenerar otros tejidos.

Fuente: http://www.cronica.com.mx/notaOpinion.php?id_nota=698890

Tarea: Tabla de Volumenes a Esterilizar por Tiempo

Métodos de esterilización 

Los métodos convencionalmente usados se pueden clasificar de acuerdo al agente y/o proceso esterilizante en: 

•  Calor húmedo 
•  Calor seco 
•  Químicos 
•  Radiaciones 
•  Filtración

Vapor saturado a presión superior a la normal 

Bajo estas condiciones se logran temperaturas superiores al punto de ebullición del agua. Generalmente se emplea una presión de vapor de una atmósfera por encima de la presión normal, lo que corresponden a una temperatura de 121°C. El poder de penetración del vapor a esta temperatura es muy alto, lo suficiente como para destruir en 15 a 20 minutos, dependiendo del volumen del material a esterilizar, esporas que sobrevivirían a la ebullición durante horas. Por éste método se pueden esterilizar soluciones, medios de cultivo, material de vidrio, ropa, en general materiales que soporten la temperatura de esterilización. 

Existen varios tipos de autoclaves siendo el más comúnmente usado el de Chamberland. El equipo consiste en una caldera metálica (en general de cobre) rodeada por una camisa externa también metálica de forma cilíndrica, en cuya parte inferior, y por debajo de la caldera, se encuentra la fuente de calor. 

La caldera lleva en su interior un doble fondo desmontable y perforado sobre el cual se coloca el material a esterilizar. La parte superior cierra con una tapa de bronce que ajusta perfectamente mediante una junta de goma de siliconas y una serie de tornillos de bronce. La tapa presenta tres elementos que comunican con el interior de la caldera: el manómetro, que generalmente indica presión sobre la atmosférica, la válvula de seguridad, y la llave de salida de vapor o espita. 

Instrucciones para su uso.

Cuando el autoclave se usa con vapor saturado a presión superior a la normal se deben seguir los siguientes pasos:

1. Colocar agua en la caldera procurando que su nivel no alcance a los objetos que se colocarán en su interior. AL material a esterilizar sólo le debe llegar el vapor que es el agente esterilizante. 

2. Cargar el material a esterilizar debidamente acondicionado. 

3. Cerrar el autoclave ajustando los tornillos de su tapa en posición cruzada, a fin de asegurar un cierre parejo y hermético. De ésta manera se prolonga la vida útil de la junta de siliconas, cuyo espesor debe ser homogéneo en todo el recorrido. 

4. Abrir la salida de vapor y encender la fuente de calor. 

5. Asegurarse el correcto estado de la válvula de seguridad. 

6. La salida de vapor debe estar abierta para desalojar el aire interior, hasta que salga un chorro continúo y abundante de vapor. La temperatura de trabajo, 121°C se alcanzará a la presión de una atmósfera sobre la normal solo si dentro del autoclave existe vapor en equilibrio con el agua, por lo cual es necesario asegurar la eliminación de aire del interior de la caldera. Si no se logra la adecuada eliminación del aire, la presencia de aire mezclado con vapor de agua resultara en una temperatura inferior a 121°C. De lo dicho se deduce que el manómetro podrá marcar una atmósfera de sobrepresión, pero si no se ha efectuado una correcta eliminación de aire la temperatura será inferior a la esperada. 

7. Purgar el aparato: se cierra y se abre tres veces la llave de salida de vapor, para eliminar los restos de aire. 

8. Cerrar. Calentar hasta que el manómetro indique la presión deseada. Regular la fuente de calor para mantener la presión constante. A partir de ese momento comenzar a contar el tiempo de esterilización. 

El tiempo de exposición varía con el volumen de los líquidos contenidos en distintos recipientes:

                           

Los tiempos son válidos para un tratamiento a 121C 

Una vez transcurrido el tiempo de tratamiento, apagar la fuente de calor y esperar que el manómetro marque cero. Recién en ese momento se puede abrir la llave de salida de vapor y luego la tapa del autoclave para retirar el material. 

Vapor fluente o vapor a presión normal

El autoclave puede utilizarse empleando vapor saturado a 100 C (presión atmosférica). En este caso se trabaja con la llave de salida de vapor abierta. Cuando sale un chorro de vapor continuo y abundante, se purga el aparato y se deja abierta la llave. A partir de ese momento se cuenta el tiempo de exposición. 

Este proceso conocido como tyndalización utiliza la acción intermitente del vapor o la esterilización fraccionada. Se utiliza para la esterilización de materiales que no soportan temperaturas superiores a 100 °C. El proceso consiste en un calentamiento a 100°C durante 30 minutos en el que mueren las bacterias en estado vegetativo. Luego se deja a temperatura ambiente durante una noche y se repite la operación, se deja nuevamente a temperatura ambiente y se procede aun tercer y último calentamiento. 

El método se basa en que en el primer calentamiento se logra destruir las formas vegetativas y se estimula la sensibilización de las formas esporuladas por acción de la temperatura y el medio líquido. En los posteriores calentamientos las formas esporuladas , ahora sensibilizadas, serán destruidas. 

Este método puede utilizarse para la esterilización de leche, gelatina nutritiva, solución de azúcares con concentraciones superiores al 10 %, etc. 

Fuente:  http://www.biol.unlp.edu.ar/microbiologiagral/anexo-lab2esterilizacion.doc

2.2.7. Esterilización de Medios de Cultivo

El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).

Vapor a presión: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como grados de temperatura y tiempo de exposición, que junto con el tamaño del autoclave y el flujo del vapor, la densidad y el tamaño de la carga en la cámara aumentan la tasa se muerte de los microorganismos, en una temperatura de 121ºC – 132ºC durante 15 minutos o más.

Ventajas:

• Es más fácil segura y eficaz
• El uso del vapor es el procedimiento más rápido, el ciclo total de tiempo es más corto
• Es más barato y de obtención más fácil
• La mayoría de las autoclaves poseen controles automáticos y dispositivos de control

Desventajas:

• Se requiere mucho cuidado en la preparación y confección de bultos, en la carga y manejo del autoclave, así como el secado de los artículos
• Los artículos a esterilizar deben estar limpios, sin grasa ni aceite
• El vapor tiene que estar en contactó directo con todas las partes de los artículos
• Los ciclos de tiempo se ajustan según el tipo de material y tamaño de la carga.

En muchos aspectos un autoclave se parece a una olla de presión casera. De hecho, en algunos pequeños laboratorios demicrobiología se utilizan estas ollas en lugar de autoclaves. Ambos son recipientes de metal con paredes suficientemente fuertes para resistir la presión de vapor.

Fuente: http://www.slideshare.net/manueltoledo91/esterilizacion-y-medios-de-cultivo