Hibridación Southern blot (SB). Necesita de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación de ARN y proteinas de la misma por digestión enzimática. Con la aplicación de endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo un patrón característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana realizándose una hibridación. El SB es el método de referencia actual para el tipaje de HPVs. La especificidad de esta técnica es superior a cualquier otra debido a la purificación extra del ADN por electroforesis. Además es el único método que permite conocer si el genoma viral está en situación episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad técnica, duración de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente.
Detalle de la tecnica de Southern
Esta técnica fue descrita por el Dr. Southern en 1975 y constituye el método más utilizado para analizar la estructura del ADN cortado por enzimas de restricción. Para la realización de esta técnica se debe extraer ADN genómico de linfocitos de sangre periférica para conocer el genotipo normal del individuo y ADN del tejido tumoral. Con una muestra de 10 cm3 de sangre se pueden extraer de 200 a 300 nanogramos de ADN con lo que se pueden realizar de 20 a 30 "digestiones" con enzimas de restricción.
La técnica de Southern Blotting permite identificar uno o dos fragmentos de ADN de interés en el aparentemente uniforme colección de millón de fragmentos cortados con la enzima de restricción. El siguiente paso consiste en la desnaturalización de los fragmentos de cadena doble para obtener fragmentos de cadena única. Esto se logra con un bufer de Ph básico.
La técnica consiste en cortar el DNA conenzimas de restricción para producirfragmentosde diferente tamaño. Los fragmentos seseparan por su tamaño molecularmedianteelectroforesis en gel de agarosa ytinción con bromuro de etidio (Rybicki yPurves, 1996). Losfragmentos son luego transferidos a una membrana que actúa como filtro. Para ello el gel se sumergeen una solución salina para denaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel secante quelas recibe y acepta debido a sus propiedades químicas. Después los fragmentos se fijan (por UV) alfiltro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tengauna secuencia complementaria a la del fragmento en cuestión. Después de la hibridación, se lava elfiltro y los fragmentos se detectan por radioautografía o mediante fluorescencia (en caso de marcajeno-radioctivo).
Southern Blot
El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA,mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas.Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemploutilizandosonicación ó enzimas de restricción.Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel deagarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan aun filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon.A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada,específica para la secuencia que se deseaidentificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá a lasecuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementariasde ácidos nucleicos.El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento debases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente.Cabe señalar que el nombre de la técnica Southern Blot deriva en parte del apellido Southern delinvestigador que la desarrolló y de la palabra en inglés Blot que significa traspasar.
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