domingo, 14 de octubre de 2012

2.2.7. Esterilización de Medios de Cultivo


El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).

Vapor a presión: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como grados de temperatura y tiempo de exposición, que junto con el tamaño del autoclave y el flujo del vapor, la densidad y el tamaño de la carga en la cámara aumentan la tasa se muerte de los microorganismos, en una temperatura de 121ºC – 132ºC durante 15 minutos o más.

Ventajas:

  • Es más fácil segura y eficaz
  • El uso del vapor es el procedimiento más rápido, el ciclo total de tiempo es más corto
  • Es más barato y de obtención más fácil
  • La mayoría de las autoclaves poseen controles automáticos y dispositivos de control
Desventajas:

  • Se requiere mucho cuidado en la preparación y confección de bultos, en la carga y manejo del autoclave, así como el secado de los artículos
  • Los artículos a esterilizar deben estar limpios, sin grasa ni aceite
  • El vapor tiene que estar en contactó directo con todas las partes de los artículos
  • Los ciclos de tiempo se ajustan según el tipo de material y tamaño de la carga.

En muchos aspectos un autoclave se parece a una olla de presión casera. De hecho, en algunos pequeños laboratorios demicrobiología se utilizan estas ollas en lugar de autoclaves. Ambos son recipientes de metal con paredes suficientemente fuertes para resistir la presión de vapor.


2.2.6. Esterilización de Material de Cristalería y Otros

El material de cristaleria que se va esterilizar debe tener una preparacion previa evitar que se vuelvan a contaminar con posterioridad a su esterilización y mantenerlas en esas condiciones hasta su utilización.

Tubos de ensayos: Se taponean con algodón y se envuelven con papel de estraza en grupos de 5 a 10 tubos.
Placas de Petry: Después de ensambladas (tapa y caja) podrán ser colocadas dentro de un cilíndrico de metal inoxidable con tapa, fabricado específicamente para ese uso, o en su defecto, las placas serán empaquetadas con papel de estraza, individualmente, en parejas o en grupos de no más de 5 placas.
Las pipetas: Se taponean de tal manera que no dificulte la succión, pero al mismo tiempo impida el paso hacia la boca del material que esté pipeteando.

Los materiales de cristalería para esterilización se lavan con agua y jabón y después se secan con papel secante.
Vasos de precipitado: se rellenan de algodón o gasa y después se envuelven en papel estraza y se aseguran con cinta adhesiva.
Se colocan los materiales asegurados con cuidado en el autoclave por 20 minutos a una presión de 15 PSI.

Otros
Autoclave: se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland. Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos. 

El laboratorio puede hacer un control diario, al azar se elige un material de vidrio limpio y seco, examinamos si hay manchas de agua, si es así el material no está bien lavado. Todo el material lavado ese día tiene que ser lavado y secado y eso quedaría reflejado en un documento llamado hoja de control de calidad. Otra forma sería el control semanal, se miraría otra vez si hay manchas de agua que indica un enjuague insuficiente, escurrido con agua desionizada, para reconocer siel recipiente está limpio nos fijaríamos si al llenarlo con agua sus paredes se humedecen formando como una partícula uniforme, al escurrirlo y sacarle el agua hay que fijarse que el agua discurre perfectamente, si hay suciedad, hay gotitas de agua que quedan retenidas. Otras veces se prepara una mezcla de detergente y se le añadeuna solución de bromo sulftadeína sódica, enjuagamos el recipiente con esa mezcla, si observamos que aparece una coloración rosa es indicativo de suciedad.


2.2.5. Esterilización con Calor Húmedo

El calor húmedo es la forma de vapor saturado a presión es eficaz parala destrucción de todas las formas microbianas, incluso espora. La muerte de las bacterias es causada por la desnaturalización y coagulación de su proteína o su sistema intercelular enzima-proteína. Estas reacciones son catolizadas por medio del agua. Estas pueden de dos tipos:

Calor húmedo discontinuo: algunos medios de cultivo que contiene carbohidratos como lagelatina, leche, etc. no soportan temperaturas elevadas y se realiza mediante los siguiente procedimientos:

  • Tindalización: hace uso del calor húmedo, para una buena esterilización se deberealizar a 100ºC por ½ hora (por tres veces discontinuas) durante 1 día.
  • Ebullición: es el paso de un líquido al estado de vapor. El agua en ebullición representaen forma eficaz y práctica de proporcionar una desinfección de alto nivel deinstrumentos y guantes que entren en contacto de las membranas mucosas, si bien alhervirlos por 20 minutos se aniquilan todas las formas vegetativas de las bacterias, losvirus, las levaduras y los hongos, pero no destruye a las esporas.
  • Pasteurización: elimina a todos los microorganismos no esporulados se puede variar lastemperaturas por ejemplo: 62ºC por 30 min.; 70ºC por 15 min. Se utiliza para preservar alimentos como ser leche, cerveza.

Vapor a presión: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables comogrados de temperatura y tiempo de exposición, que junto con el tamaño del autoclave y el flujo delvapor, la densidad y el tamaño de la carga en la cámara aumentan la tasa se muerte de los microorganismos, en una temperatura de 121ºC – 132ºC durante 15 minutos o más.
Ventajas:
  • Es más fácil segura y eficaz
  • El uso del vapor es el procedimiento más rápido, el ciclo total de tiempo es más corto
  • Es más barato y de obtención más fácil
  • La mayoría de las autoclaves poseen controles automáticos y dispositivos de control.
Desventajas:
  • Se requiere mucho cuidado en la preparación y confección de bultos, en la carga y manejo delautoclave, así como el secado de los artículos
  • Los artículos a esterilizar deben estar limpios, sin grasa ni aceite
  • El vapor tiene que estar en contactó directo con todas las partes de los artículos
  • Los ciclos de tiempo se ajustan según el tipo de material y tamaño de la carga
  • El vapor puede no ser puro

La cámara presurizada utilizada normalmente en el laboratorio es el autoclave.En muchos aspectos una autoclave se parece a una olla de presión casera. De hecho, en algunos pequeños laboratorios de microbiología se utilizan estas ollas en lugar de autoclaves. Ambos son recipientes de metal con paredes suficientemente fuertes para resistir la presión de vapor.
Las autoclaves son grandes cámaras de acero inoxidable que funcionan automáticamente. Los objetos deben ser colocados de manera que el vapor de agua entre en contacto con todas las partes de cada uno de ellos, y el aire no quede atrapado en su interior. El aire que no es reemplazado por vapor crea una bolsa seca, donde la esterilización no será efectiva.

2.2.4. Factores que Intervienen en el Proceso de Esterilización

La eficacia de un proceso de esterilización depende de cómo se realice el proceso en sí y de múltiples factores relacionados con el objeto: estructura física, nivel de contaminación inicial, de limpieza, compatibilidad con el proceso de esterilización, tipo de envoltorio, etc. Todas las fases de un proceso de esterilización (limpieza, preparación del equipo, esterilización, almacenaje y transporte) deben validarse y controlarse.



Factores relacionados con el objeto


Nivel de contaminación del objeto: presencia de materia orgánica y de
Microorganismos

Pueden alterar y condicionar el proceso de esterilización y derivar al fracaso del mismo. La presencia de proteínas protege a los microorganismos frente a la acción de los agentes esterilizantes, específicamente los químicos. Con el fin de eliminar la materia orgánica y reducir la carga microbiana (y garantizar con ello la eficacia del proceso de esterilización), el material debe descontaminarse previamente mediante una limpieza exhaustiva. Algunos autores demuestran que después de una limpieza minuciosa de material de difícil acceso contaminado artificialmente (fibroscopios, agujas espinales, catéteres,...) se logra una reducción microbiana de entre un 99.90% y un 99.99%.


Configuración física del material:

Los avances científicos en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades han desarrollado una gran diversidad de material crítico con distinta forma, tamaño, complejidad, fragilidad y sensibilidad. En función de su estructura y configuración física se elegirá un determinado procedimiento de esterilización. En el Real Decreto 414/1996 del 1 de Marzo, transposición de la Directiva 1993/42/CEE, se regulan y clasifican los productos sanitarios; en él se especifica la responsabilidad del fabricante de describir las condiciones requeridas para reprocesar el material, sin modificar su funcionalidad y características. El profesional sanitario tiene la responsabilidad de aplicar el proceso de esterilización más adecuado y demostrar que puede reproducirlo exactamente. El proceso de esterilización supone un reto importante para el material con luces o conductos largos o con espacios muertos. Para estos instrumentos será necesaria la aplicación de prácticas específicas.


Limpieza del material previa a la esterilización:

El proceso de limpieza se define como la aplicación de un procedimiento físico-químico encaminado a eliminar la suciedad y otros materiales ajenos al objeto. La limpieza previa de un objeto es una práctica indispensable para garantizar la efectividad de un proceso de desinfección o esterilización. El agua y los detergentes usados en la limpieza deben reunir unas características determinadas.

Agua: Es importante verificar la calidad del agua para conseguir la máxima eficacia del detergente. Un agua dura puede disminuir su efectividad. Para evitar la corrosión del instrumental quirúrgico se recomienda la utilización de agua desmineralizada durante el proceso de limpieza o, como mínimo, en el último aclarado. Nunca debe utilizarse suero fisiológico para limpiar y/o aclarar el instrumental porque puede producir corrosión. Es también importante controlar la temperatura del agua, que no ha de ser excesivamente elevada (entre 20ºC y 45ºC); temperaturas altas favorecen la coagulación de la albúmina y dificultan su eliminación.

El detergente: Los detergentes neutros (pH 7) están indicados para la limpieza de instrumental quirúrgico delicado, pero son menos eficaces para la eliminación de sustancias orgánicas. Algunos sistemas automatizados de lavado de instrumental utilizan detergentes ligeramente alcalinos (pH de 8 a 11) que se neutralizan posteriormente en el aclarado. Se ha demostrado que los detergentes enzimáticos son más efectivos que los detergentes alcalinos para la limpieza del material de difícil acceso. Su eficacia está relacionada con el hecho de contener endopeptidasas, enzimas que hidrolizan los enlaces de la molécula proteica y facilitan así la eliminación de contaminantes de base proteica como sangre y secreciones.

En la limpieza previa a la esterilización no está indicado el uso de detergentes desinfectantes, pues se inactivan fácilmente en presencia de materia orgánica y reducen poco la carga microbiana, proporcionando una falsa seguridad a las personas que los utilizan. Cuando se utilice un detergente en polvo hay que tener la precaución de disolverlo previamente, ya que podría obstruir canales o iniciar un proceso de corrosión si alguna partícula quedase incrustada en alguna ranura del instrumental. Deben evitarse los detergentes espumantes porque dificultan el contacto del detergente con el objeto. Los detergentes deben diluirse correctamente según las indicaciones de cada fabricante.

2.2.3. Tipos de Esterilizacion

Esterilización por calor:
El calor es el método de elección para esterilizar el material de laboratorio resistente a las altas temperaturas. La temperatura y el tiempo requeridos para esterilizar un material dependende que se esté utilizando calor seco o calor húmedo.

Esterilización con calor seco: La acción bactericida del calor seco se debe a la oxidación física de un procedimiento lento o coagulación de la proteína bacteriana por quemadura. En ausencia de humedad se necesita una temperatura más alta,ya que en esta forma los microbios son destruidos al absorber el calor. Pueden ser dos tipos:
  • Directa: flameado o incineración más utilizada enlaboratorios y en algunos hospitales pequeños.
  • Indirecto: aire caliente u horno de Pasteur con temperatura de 160ºC a 180ºC por 1 a 2 horas siendoel más eficaz y seguro el eléctrico.

Esterilización con calor húmedo:El calor húmedo es la forma de vapor saturado a presión es eficaz para la destrucción de todas las formas microbianas, incluso espora. La muerte de las bacterias es causada por la desnaturalización y coagulación de su proteína o su sistema intercelular enzima-proteína. Estas reacciones son catolizadas por medio del agua. Estas pueden de dos tipos:

  • Calor húmedo discontinuo: algunos medios de cultivo que contiene carbohidratos como lagelatina, leche, etc. no soportan temperaturas elevadas.
  • Vapor a presión: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables comogrados de temperatura y tiempo de exposición, que junto con el tamaño del autoclave y el flujo delvapor, la densidad y el tamaño de la carga en la cámara aumentan la tasa se muerte de losmicroorganismos, en una temperatura de 121ºC – 132ºC durante 15 minutos o más.

Esterilización por radiación:
La ionización por radiación genera iones al liberar electrones de losátomos, estos se desprenden violentamente con átomos adyacentes y se une a ellos, o bien se desprenden del segundo átomo. La energía liberada se transforma en energía térmica o química la cual causa la muerte de los microorganismos al romper la molécula del ADN e impide la división molecular y la propagación de la vida. Las principales fuentes de radiación ionizante son las partículas Beta y rayos gamma.

Esterilización por gas oxido de etileno:
Este es un gas incoloro, soluble en agua y en solventes comunes, se emplea para esterilizar objetos sensibles al calor, este proceso es relativamente lento. El poder bactericida depende de la concentración del mismo gas, temperatura, humedad y tiempo de exposición. La actividad esporicida se produce por aniquilación de los grupos terminales hidroxilo,carboxilo, amino y sulfridrilo.

Esterilización por glutaraldehido:
La solución acuosa de glutaraldehido activado y amortiguado al 2%,destruye a los microorganismos por desnaturalización de la proteína. Es preferida para esterilizar instrumentos que no pueden esterilizarse al vapor o no se cuenta con otro método de esterilización.

Filtración:
Las células microbianas pueden retirarse de los líquidos o gases por filtración. La filtración es lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razón, se utiliza sólo para los líquidos termolábiles, que no se pueden esterilizar en el autoclave. Los sólidos termolábiles también se pueden esterilizar por filtración, si previamente se disuelven en un líquido. Técnicamente, la filtración no esteriliza porque los virus pueden pasar a través de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayoría de los estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio.

2.2.2. Definicion

La esterilización es un proceso a través del que se puede lograr la destrucción total de los microorganismos viables presentes en un determinado material. Este procedimiento es de gran utilidaddentro del campo farmacéutico, ya que existen muchos procesos que requieren la utilización demateriales estériles.


La esterilización es un método de control del crecimiento microbiano que involucra la eliminación de todas las formas de vida microscópicas, incluidos virus y esporas, la temperatura utilizada para la destrucción de los mismos, es de 100 °C en adelante. Es un término absoluto que implica la pérdida de la viabilidad mediante la destrucción de todos los microorganismos contenidos en un objeto, área específica o sustancia, acondicionando de tal modo la posterior propagación o contaminación a otros objetos o al medio ambiente.

2.2.1. Generalidades

El proceso de esterilización consiste en destruir los organismos vivos que se encuentran en los alimentos, mediante el proceso de exponerles a las temperaturas adecuadas y así poder conservarles durantes largos periodos (algunos hasta meses).

La esterilización consiste en elevar la temperatura de la preparación por encima de los 65º C (temperatura donde los bacterias se desnaturalizan), se mantiene esa temperatura durante 10 minutos, para proceder a bajar rápidamente la temperatura hasta por debajo de los 5º C; para enfriar con rapidez se usa el abatidor de frío o bien de forma casera se recurre a un baño de agua fría con cantidad de hielo. Si el proceso de bajada de temperatura no se hace correctamente, la descomposición seguirá su curso normal, como si no hubiese esterilizado. Especialmente viable para la conservación de salsas, fondos y bases, permite su conservación por 3 o 4 meses.