domingo, 28 de octubre de 2012

2.3.1.2. Multiplicacion

Multiplicación: esto es para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.
El objetivo principal de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicación sucesivos (subcultivos) y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa de producción.

                            

Fuente: http://es.wikipedia.org/wiki/Micropropagaci%C3%B3n

2.3.1.1. Establecimiento Aseptico

Consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán ventajosamente con el explanto


Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

Es el establecimiento aséptico de tejidos vegetales,con un propósito determinado:
• Limpieza  de virus y otros patógenos.
• Multiplicación clonal masiva.
• Resistencia a plagas y enfermedades.
• Resistencia a la toxicidad y otras condiciones ambientales adversas.
• Intercambio y la conservación de germoplasma.


2.3.1. Etapas del Cultivo de Tejidos

Pasos necesarios para generar plantas a partir de explantos aislados.




2.3. Establecimiento del Cultivo de Tejidos

El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denominará explanto, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas. 

La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido des diferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales.
El éxito en la propagación de una planta dependerá de la posibilidad de expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. A tal fin, debe inducirse primero la des diferenciación y luego la rediferenciación celular. Un proceso de este tipo sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias, o cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana (ver figura 1) opeperonias mediante porciones de hojas. Uno de los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada es la composición del medio de cultivo. 

El establecimiento consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán ventajosamente con el explanto.

viernes, 19 de octubre de 2012

Tarea: Ensayo del Premio Nobel de Medicina 2012



Resumen

Gurdon y Yamanaka (2012) descubrieron que “las células maduras pueden ser reprogramadas a células pluripotenciales”. Este anuncio, esperado por la comunidad científica en los años recientes, ofrece oportunidad para hacer una serie de reflexiones que son de particular importancia para la sociedad actual en que vivimos.

Gamba Ayala (2012) opinó que las células pluripotenciales o “Stem cells” son originalmente las células que fuimos todos nosotros durante la etapa embrionaria. Son células que tienen la capacidad de diferenciarse en diversos tipos de células adultas. Así, de un solo óvulo fecundado, es decir, de una sola célula, eventualmente se genera un individuo que tiene todo tipo de células maduras, especializadas, como neuronas, hepatocitos, fibroblastos, células pancreáticas, miocitos cardiacos, etcétera. Muchas enfermedades resultan por la mortalidad o el malfuncionamiento de células adultas, como varios tipos de cáncer, o por ejemplo, la muerte de miocitos cardiacos después de un infarto, o la mala regulación/producción de ciertos neurotransmisores, como en el caso de los ganglios basales en la enfermedad del Parkinson. Por esto, la idea de generar nuevas células maduras, especializadas, que puedan suplantar a las que se murieron o enfermaron, promete ser una terapia útil para diversos padecimientos. Sin embargo, para poder siquiera pensar en esta posibilidad, lo primero que necesitamos tener en las manos son las células pluripotenciales.

Gurdon y Yamanaka (2012) demostraron que al manipular unos cuantos genes es posible tomar una célula especializada de adulto e inducirla a convertirse en una célula pluripotencial. A estas células las llamaron células pluripotenciales inducibles (iPS). Así, tomaron fibroblastos de un ratón adulto y los convirtieron en iPS. Por lo tanto, a partir de entonces se abrió la posibilidad hacia el futuro de tomar células especializadas de un adulto, por ejemplo, de la piel de un paciente que sufrió un infarto, convertirlas en pluripotenciales y posteriormente derivarlas a formar las células que se necesitan para regenerar el miocardio de ese paciente. De esta forma, ya no se requieren embriones y se elimina el problema de rechazo, porque las células vienen del mismo paciente.

Opinión

Al leer el articulo sobre el Premio Nobel de Medicina a cerca de las células madre pluripontenciales inducidas entendí que las células adultas pueden ser reprogramadas y convertirse en células madre pluripotenciales o también llamadas células madre pluripotenciales inducidas (iPS). Estas células están presentes en la etapa embrionaria, y tienen la capacidad de diferenciarse en diversos tipos de células adultas. Así, de un solo óvulo fecundado, es decir, de una sola célula, eventualmente se genera un individuo que tiene todo tipo de células maduras especializadas, como neuronas, hepatocitos, fibroblastos, etcétera. Ya que muchas enfermedades son causadas por la mortalidad o el malfuncionamiento de células adultas, por ejemplo el cáncer y la enfermedad del Parkinson, la idea de generar nuevas células maduras especializadas, que puedan suplantar a las que se murieron o enfermaron, promete ser una terapia útil para diversos padecimientos. 
En 1962, John B. Gurdon,196 demostró que el núcleo de una célula adulta, especializada, todavía conserva la información para ser pluripotencial, pero que en el medio en que vive, ésta se encuentra apagada. Esto lo demostró al cambiar el núcleo de un ovocito de rana, por el núcleo de una célula del intestino y mostrar que el óvulo con el nuevo núcleo -del intestino- podía producir un renacuajo y eventualmente una rana adulta. En otras palabras, el núcleo de la célula del intestino todavía “recordaba” cómo ser pluripotencial, sólo había que ponerla en el medio adecuado. Por otro lado, en el 2006, Shinya Yamanaka y su grupo demostraron que al manipular unos cuantos genes es posible tomar una célula especializada de adulto e inducirla a convertirse en una célula pluripotencial. A estas células las llamaron iPS; así tomaron fibroblastos de un ratón adulto y los convirtieron en iPS. Por lo tanto, a partir de estos dos hallazgos, se abrió la posibilidad hacia el futuro de tomar células especializadas de un adulto, y posteriormente derivarlas a formar las células que se necesitan para regenerar otros tejidos.

miércoles, 17 de octubre de 2012

Tarea: Tabla de Volumenes a Esterilizar por Tiempo



Métodos de esterilización 

Los métodos convencionalmente usados se pueden clasificar de acuerdo al agente y/o proceso esterilizante en: 

  •  Calor húmedo 
  •  Calor seco 
  •  Químicos 
  •  Radiaciones 
  •  Filtración

Vapor saturado a presión superior a la normal 

Bajo estas condiciones se logran temperaturas superiores al punto de ebullición del agua. Generalmente se emplea una presión de vapor de una atmósfera por encima de la presión normal, lo que corresponden a una temperatura de 121°C. El poder de penetración del vapor a esta temperatura es muy alto, lo suficiente como para destruir en 15 a 20 minutos, dependiendo del volumen del material a esterilizar, esporas que sobrevivirían a la ebullición durante horas. Por éste método se pueden esterilizar soluciones, medios de cultivo, material de vidrio, ropa, en general materiales que soporten la temperatura de esterilización. 

Existen varios tipos de autoclaves siendo el más comúnmente usado el de Chamberland. El equipo consiste en una caldera metálica (en general de cobre) rodeada por una camisa externa también metálica de forma cilíndrica, en cuya parte inferior, y por debajo de la caldera, se encuentra la fuente de calor. 

La caldera lleva en su interior un doble fondo desmontable y perforado sobre el cual se coloca el material a esterilizar. La parte superior cierra con una tapa de bronce que ajusta perfectamente mediante una junta de goma de siliconas y una serie de tornillos de bronce. La tapa presenta tres elementos que comunican con el interior de la caldera: el manómetro, que generalmente indica presión sobre la atmosférica, la válvula de seguridad, y la llave de salida de vapor o espita. 


Instrucciones para su uso.

Cuando el autoclave se usa con vapor saturado a presión superior a la normal se deben seguir los siguientes pasos:

1. Colocar agua en la caldera procurando que su nivel no alcance a los objetos que se colocarán en su interior. AL material a esterilizar sólo le debe llegar el vapor que es el agente esterilizante. 

2. Cargar el material a esterilizar debidamente acondicionado. 

3. Cerrar el autoclave ajustando los tornillos de su tapa en posición cruzada, a fin de asegurar un cierre parejo y hermético. De ésta manera se prolonga la vida útil de la junta de siliconas, cuyo espesor debe ser homogéneo en todo el recorrido. 

4. Abrir la salida de vapor y encender la fuente de calor. 

5. Asegurarse el correcto estado de la válvula de seguridad. 

6. La salida de vapor debe estar abierta para desalojar el aire interior, hasta que salga un chorro continúo y abundante de vapor. La temperatura de trabajo, 121°C se alcanzará a la presión de una atmósfera sobre la normal solo si dentro del autoclave existe vapor en equilibrio con el agua, por lo cual es necesario asegurar la eliminación de aire del interior de la caldera. Si no se logra la adecuada eliminación del aire, la presencia de aire mezclado con vapor de agua resultara en una temperatura inferior a 121°C. De lo dicho se deduce que el manómetro podrá marcar una atmósfera de sobrepresión, pero si no se ha efectuado una correcta eliminación de aire la temperatura será inferior a la esperada. 



7. Purgar el aparato: se cierra y se abre tres veces la llave de salida de vapor, para eliminar los restos de aire. 


8. Cerrar. Calentar hasta que el manómetro indique la presión deseada. Regular la fuente de calor para mantener la presión constante. A partir de ese momento comenzar a contar el tiempo de esterilización. 

El tiempo de exposición varía con el volumen de los líquidos contenidos en distintos recipientes:

                           
Los tiempos son válidos para un tratamiento a 121C 

Una vez transcurrido el tiempo de tratamiento, apagar la fuente de calor y esperar que el manómetro marque cero. Recién en ese momento se puede abrir la llave de salida de vapor y luego la tapa del autoclave para retirar el material. 

Vapor fluente o vapor a presión normal


El autoclave puede utilizarse empleando vapor saturado a 100 C (presión atmosférica). En este caso se trabaja con la llave de salida de vapor abierta. Cuando sale un chorro de vapor continuo y abundante, se purga el aparato y se deja abierta la llave. A partir de ese momento se cuenta el tiempo de exposición. 

Este proceso conocido como tyndalización utiliza la acción intermitente del vapor o la esterilización fraccionada. Se utiliza para la esterilización de materiales que no soportan temperaturas superiores a 100 °C. El proceso consiste en un calentamiento a 100°C durante 30 minutos en el que mueren las bacterias en estado vegetativo. Luego se deja a temperatura ambiente durante una noche y se repite la operación, se deja nuevamente a temperatura ambiente y se procede aun tercer y último calentamiento. 

El método se basa en que en el primer calentamiento se logra destruir las formas vegetativas y se estimula la sensibilización de las formas esporuladas por acción de la temperatura y el medio líquido. En los posteriores calentamientos las formas esporuladas , ahora sensibilizadas, serán destruidas. 

Este método puede utilizarse para la esterilización de leche, gelatina nutritiva, solución de azúcares con concentraciones superiores al 10 %, etc. 



Fuente:  http://www.biol.unlp.edu.ar/microbiologiagral/anexo-lab2esterilizacion.doc

domingo, 14 de octubre de 2012

2.2.7. Esterilización de Medios de Cultivo


El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).

Vapor a presión: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como grados de temperatura y tiempo de exposición, que junto con el tamaño del autoclave y el flujo del vapor, la densidad y el tamaño de la carga en la cámara aumentan la tasa se muerte de los microorganismos, en una temperatura de 121ºC – 132ºC durante 15 minutos o más.

Ventajas:

  • Es más fácil segura y eficaz
  • El uso del vapor es el procedimiento más rápido, el ciclo total de tiempo es más corto
  • Es más barato y de obtención más fácil
  • La mayoría de las autoclaves poseen controles automáticos y dispositivos de control
Desventajas:

  • Se requiere mucho cuidado en la preparación y confección de bultos, en la carga y manejo del autoclave, así como el secado de los artículos
  • Los artículos a esterilizar deben estar limpios, sin grasa ni aceite
  • El vapor tiene que estar en contactó directo con todas las partes de los artículos
  • Los ciclos de tiempo se ajustan según el tipo de material y tamaño de la carga.

En muchos aspectos un autoclave se parece a una olla de presión casera. De hecho, en algunos pequeños laboratorios demicrobiología se utilizan estas ollas en lugar de autoclaves. Ambos son recipientes de metal con paredes suficientemente fuertes para resistir la presión de vapor.