El cultivo de ápices caulinares in vitro, que resulta eficaz para obtener plantas libres de patógenos en numerosas especies vegetales, no ha resultado exitoso en los cítricos por no haberse alcanzado regeneración de plantas completas a partir de esos ápices. Como alternativa para lograr plantas de cítricos libres de patógenos, se ha desarrollado la técnica de microinjerto de ápices caulinares in vitro. Esta técnica constituye en la actualidad la vía por excelencia para disponer del material de propagación certificado que se lleva a las plantaciones comerciales, garantizar el estado sanitario de las accesiones de un banco de germoplasma de cítricos para su utilización en los programas de mejoramiento genético y conservar adecuadamente estos valiosos recursos fitogenéticos.
El microinjerto ha demostrado ser eficaz en la eliminación de todos los patógenos que se han intentado eliminar por esta vía, incluyendo aquellos para los que la termoterapia no es exitosa, además de que las plantas sanas obtenidas por microinjerto presentan características idénticas a la planta madre.
El procedimiento descrito por Navarro y col. (1975) para el microinjerto de ápices caulinares in vitro consta de las etapas que a continuación se relacionan.
o Preparación del patrónEs necesario disponer de patrones logrados por germinación de semillas in vitro. Las semillas que se utilicen deben proceder de árboles libres de patógenos, al menos de aquellos que se transmiten por semillas.
Teóricamente cualquier patrón que sea compatible con la variedad que sobre él se injerte puede ser usado para el microinjerto. A pesar de que el patrón más utilizado ha sido el citrange ‘Troyer’ (Poncirus trifoliata (L.) Raf. X Citrus sinensis (L.) Osb.) se han empleado Poncirus trifoliata, limonero ‘Rugoso’ (Citrus jambhiri Lush.), cidro ‘Etrog’ (Citrus medica L.) y Citrus macrophylla Wester, entre otros. La utilización de estos patrones se debe a diversas causas como son la facilidad que ofrecen los trifoliados en la identificación de los rebrotes del patrón para ser eliminados, la compatibilidad a la que se hacía referencia y los resultados del empleo de patrones más vigorosos.
Se eliminan manualmente los tegumentos de las semillas, se tratan por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio al 0,7 % durante diez minutos para la esterilización de su superficie y se enjuagan varias veces con agua destilada estéril.
Las semillas se siembran en tubos de ensayo con medio de germinación compuesto por las sales minerales de Murashige y Skoog (MS) solidificado con agar, donde permanecen en oscuridad constante a 27- 30 ºC alrededor de dos semanas, hasta que las plántulas alcanzan su desarrollo óptimo para su uso en el microinjerto o Preparación del ápice
Los ápices caulinares para el microinjerto pueden obtenerse de diversas fuentes de brotes de los árboles enfermos seleccionados: directamente en árboles que se encuentren en activa brotación vegetativa; a partir de plantas de las selecciones de interés injertadas que se mantienen en bolsas o macetas, en las que puede inducirse la brotación de sus yemas defoliándolas totalmente dos semanas antes de la fecha del microinjerto; y a partir de vástagos cultivados in vitro.
Se utilizan brotes de entre 2 y 3 cm para evitar ápices degenerados o en estado de abscisión. A cada brote se le eliminan las hojas mayores y se separa la parte terminal con una longitud de 1 cm. Posteriormente se realiza la esterilización de superficie por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio al 0,25 % más 0,1 % de Tween 20 durante cinco minutos y se enjuaga repetidas veces con agua destilada estéril.
En condiciones asépticas y con el auxilio de un microscopio estereoscópico se eliminan las hojas restantes con excepción de los tres primordios foliares más jóvenes o Microinjerto Trabajando en condiciones de esterilidad, la plántula patrón se extrae del tubo de ensayo, se decapita dejando aproximadamente 1,5 cm del epicotilo, se acorta la raíz hasta 4-6 cm y se eliminan los cotiledones junto con sus yemas axilares. Aunque se han ensayado diversas formas de injerto, se utiliza mayormente la incisión T invertida con dimensiones de 1 mm en el extremo del epicotilo decapitado.
Con el empleo de instrumentos de microdisección se aisla el ápice caulinar, menor de 0,2 mm, compuesto por el meristemo apical más los dos o tres subyacentes primordios foliares, y se coloca con la superficie de corte basal en contacto con la superficie cortical horizontal de la incisión T invertida practicada en el patrón.
Los cortes para la preparación del patrón y el aislamiento del ápice deben ser tan perfectos como sea factible y las operaciones del microinjerto deben efectuarse con la máxima rapidez
posible para evitar la desecación de los tejidos.
Se ha demostrado que aunque se logra mayor prendimiento del microinjerto con el empleo de ápices caulinares mayores, existe una relación inversa entre el tamaño de estos y el porcentaje de plantas sanas obtenidas.
Además del tamaño del ápice, otros factores influyen decisivamente en el prendimiento del microinjerto como son el patrón escogido, la variedad del ápice microinjertado, la utilización de patrones etiolados, la edad de las plántulas patrón y la destreza manual del operador.
o Mantenimiento de las plantas microinjertadas
Las plantas microinjertadas se cultivan en medio líquido compuesto por las sales minerales MS, las vitaminas de White, 100 mg/L de meso-inositol y 75 g/L de sacarosa, en tubos de ensayo con soporte de papel, que se mantienen a 27 ºC con un régimen de iluminación de 16 horas de luz y 8 de oscuridad. Debe resaltarse que también se ha conseguido un desarrollo satisfactorio de los microinjertos en cuartos de cultivo con luz natural.
o Trasplante de los microinjertos.
A las 5-8 semanas, con al menos dos hojas expandidas, las plantas microinjertadas pueden ser llevadas a condiciones ambientales externas. Una posibilidad es realizar su trasplante directamente a macetas con un sustrato apropiado, en condiciones de humedad y sombreado que favorezcan su desarrollo. Otra alternativa es reinjertar sobre patrones vigorosos, lo que permite acelerar el desarrollo de los microinjertos para disponer más rápidamente del material de propagación libre de patógenos.
La labor del microinjerto se complementa necesariamente con las pruebas de diagnóstico de
patógenos que sea preciso realizar en cada caso, para garantizar la calidad sanitaria del material de propagación obtenido. De hecho, al hacerse referencia a una planta sana o libre de patógenos, lo que se puede asegurar es que está libre de los patógenos para los que las
pruebas de diagnóstico realizadas fueron negativas.
Se ha demostrado que los principales patógenos transmisibles por injerto en los cítricos pueden ser eliminados a través del microinjerto de ápices caulinares in vitro. Los patógenos que más fácilmente se eliminan por esta vía son los viroides causantes de exocortis y cachexia, S. citri, así como los virus causantes de la tristeza de los cítricos, infection variegation y vein enation, con éxito en el 100 % de los casos o próximo a esa cifra. Resultan más difíciles de eliminar con esta técnica los virus que provocan tatter leaf, dweet mottle y psorosis, entre otros. Sin embargo, se ha encontrado que si se aumenta hasta 32 ºC la temperatura a la que se desarrollan los brotes que se emplean en el microinjerto, se elevan considerablemente los porcentajes de plantas sanas que se obtienen a partir de plantas enfermas con algunos patógenos, por lo que en varios programas de saneamiento se emplea de forma rutinaria la combinación del microinjerto con tratamientos de termoterapia.Además del patógeno de que se trate y de la temperatura a la que se desarrollen los brotes, como se señaló anteriormente, el tamaño del ápice microinjertado influye en el porcentaje de plantas sanas resultantes de la técnica de microinjerto.
Independientemente de los porcentajes que se alcancen en el prendimiento de los microinjertos y el saneamiento, lo que se pretende es obtener una fuente de material de propagación libre de patógenos a partir de una selección infectada. Este resultado puede alcanzarse con un mínimo de plantas microinjertadas que puedan suministrar yemas para propagar la variedad saneada, una vez certificada mediante las pruebas de diagnóstico que se considere oportuno realizar. De esta forma, las plantas sanas obtenidas constituyen el punto de partida del programa de producción de material de propagación certificado de cítricos.
