Normalmente, en los organismos superiores animales o vegetales la información genética se transmite por mecanismos de reproducción sexual; es lo que se conoce como transmisión genética vertical. Sin embargo, hace ya unos veinte años se logró obtener los primeros ratones transgénicos mediante transferencia génica por inyección directa de ADN extraño en un cigoto obtenido por fecundación in vitro; es decir, se trataba de una transmisión genética horizontal, también llamada transgénesis. A partir de las experiencias de Gordon, Ruddle y colaboradores iniciadas en 1980 en las que inyectaron ADN de ratón en uno de los pronúcleos de un cigoto de la misma especie, se inició una nueva era en la manipulación genética de embriones de mamíferos. Al año siguiente, Gordon y Ruddle (1981) demostraban la integración y transmisión estable a través de la línea germinal de genes inyectados en pronúcleos de cigotos de ratón obtenidos por fecundación in vitro. Eran los primeros ratones transgénicos. El paso siguiente consistió en probar que también se podían obtener ratones transgénicos que incorporaran en su genoma un gen (transgén) de otra especie. Así, Palmiter y colaboradores (1982) obtuvieron ratones transgénicos gigantes al inyectar en el pronúcleo de un cigoto el gen de la rata que codifica para la hormona del crecimiernto. Incluso, se obtuvieron también ratones transgénicos gigantes cuando el transgén introducido era el gen humano que codifica para la hormona de crecimiento (Palmiter et al., 1983).
3505.- El ratón transgénico, que lleva incorporado el gen de la hormona de crecimiento de la rata, tiene un aumento de tamaño del 80% en comparación con un ratón normal. Como era de esperar, a los ratones transgénicos siguieron los conejos, ovejas y cerdos transgénicos a los que se les había introducido por microinyección en uno de los pronúcleos del cigoto el ADN del gen humano que codifica para la hormona de crecimiento, en un intento de aumentar el tamaño de tales animales (Hammer et al., 1985). Sin embargo, este avance científico no tuvo aplicación zootécnica porque la presencia del transgén modifica la fisiología del animal transgénico, produciendo efectos colaterales perjudiciales para su desarrollo. De cualquier manera, la era de la trangénesis animal había comenzado como una realidad imparable.
4092.- Cerdo transgénico que lleva incorporado el gen humano de la hormona del crecimiento. Su desarrollo presentaba trastornos fisiológicos importantes (Fuente: M.R.Cummings, 1995, Herencia Humana, 3ª edición, Interamericana)
MAMÍFEROS TRANSGÉNICOS
Como se indicaba anteriormente, las investigaciones llevadas a cabo a principio de los años ochenta no fueron más que el lanzamiento de una serie ininterrumpida de avances, tanto en la investigación básica como en la utilización práctica de los animales transgénicos. En el cuadro adjunto se incluyen los principales hitos relacionados con la obtención y desarrollo de los mamíferos transgénicos:
1938: Spemann propone experimento de transferencia nuclear
1949: Hammond mantiene embriones de ratón en cultivo in vitro
1961: Tarkowski obtiene ratones quiméricos agregando embriones
1966: Lin describe la técnica de microinyección de embriones de ratón
1980: Gordon, Ruddle y col. obtienen los primeros ratones transgénicos por microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón
1981: Gordon y Ruddle obtienen ratones transgénicos por microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón
1981: Evans y Kaufman obtienen células embrionarias totipotentes de ratón
1982: Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediante transgenes de la hormona del crecimiento de la rata
1983: Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediante transgenes de la hormona de crecimiento humana
1983: McGrath y Solter desarrollan una nueva técnica para experimentos de transferencia nuclear en ratón
1985: Hammer y col. obtienen animales de granja transgénicos (conejos, ovejas, cerdos) con el transgén de la hormona del crecimiento humano
1987: Thomas y Capecchi obtienen los primeros ratones knockout por recombinación homóloga
1989: Clark y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano del factor IX de coagulación de la sangre mediante microinyección de ADN en el pronúcleo del cigoto
1991: Wright y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano de la a -1-antitripsina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos
1991: Ebert y col. obtienen cabras transgénicas con el gen AtPH humano (activador tisular de plasminógeno) mediante microinyección de ADN en pronúcleo de cigoto
1991: Krimpenfort y col. obtienen vacas transgénicas con el gen humano de la lactoferrina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos
1993: Nagy y Rossant obtienen ratones quiméricos por co-cultivo de embriones
1993: Schedl y col. obtienen ratones transgénicos con cromosomas artificiales de levaduras
1994: Brinster y col. obtienen ratones transgénicos por transplante de espermatogonias
1996: Campbell y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear de células embrionarias en cultivo
1997: Wilmut y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear de células diferenciadas fetales y adultas en cultivo
1997: Schnieke y col. obtienen ovejas clónicas transgénicas por transferencia nuclear a partir de células fetales diferenciadas
1998: Cibelli y col. obtienen vacas clónicas transgénicas por transferencia nuclear a partir de células fetales diferenciadas
1999: Baguisi y col. obtienen cabras transgénicas por transferencia nuclear
1999: Yanagimachi y col. obtienen ratones transgénicos mediante la co-inyección de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno
PROBLEMAS DE LA TRANSGÉNESIS
La introducción de una nueva información genética (el transgén) dentro del genoma de un organismo puede presentar algunos problemas en relación a dónde y cuándo expresar el transgén, tal como se indica a continuación:
Integración múltiple (en tándem o no)
Lugar de integración indeterminado (efecto de posición)
Metilación y falta de expresión
Mosaicismo (germinal y somático)
Expresión específica/ectópica
Expresión variable
Expresión variable dentro de líneas (variegación)
En cualquier caso, el ideal sería poder dirigir con total precisión el lugar de integración del transgén. Así, por ejemplo, en 1999 se obtuvieron en el Roslin Institute de Edinburgo las ovejas transgénicas "Cupid" y "Diana" a partir de la clonación de cultivos celulares modificados mediante recombinación homóloga ("gene targeting").
LAS GRANJAS FARMACÉUTICAS
La Biotecnología ha aplicado estas técnicas experimentales de transgénesis y ya hoy se están estableciendo las primeras granjas farmacéuticas en las que se crían ovejas, cabras, vacas o cerdos transgénicos que producen en su leche proteínas terapéuticas humanas (ver Velander et al., 1997).
La manipulación genética de un mamífero doméstico transgénico consiste, en primer lugar, en preparar el fragmento de ADN que contiene el gen humano, uniéndolo a otro fragmento de ADN correspondiente a un elemento regulador (promotor) procedente de un gen que promueve la síntesis de una proteína de la leche (por ejemplo, la b -lactoglobulina, la caseína, etc.). De esta manera se asegura que el gen humano sólo se expresará en las células de las glándulas mamarias del animal transgénico (oveja, cabra, vaca, cerdo) obtenido tras la inyección del ADN manipulado en el pronúcleo masculino de un cigoto producido por fecundación in vitro. Sin embargo, actualmente, la utilización de la técnica de clonación por transferencia de núcleos de células genéticamente modificadas resulta más ventajosa. Con esta última técnica, los investigadores del Roslin Institute de Edinburgo obtuvieron por vez primera en 1997 ovejas transgénicas procedentes de núcleos de fibroblastos fetales a los que se les había introducido el gen humano que codifica para el factor IX de coagulación de la sangre (Schnieke et al., 1997). Los resultados de estos autores demostraron además que la utilización de la técnica de clonación de los núcleos modificados genéticamente es mucho más eficaz que la técnica original de microinyección de ADN en los pronúcleos de los cigotos.
Posteriormente, con estas técnicas se ha conseguido que la leche de las hembras transgénicas contenga también otras proteínas terapéuticas humanas (a -1-antitripsina, proteína C, factor VIII de coagulación, antitrombina III, etc.) que pueden luego ser fácilmente separadas de las restantes proteínas propias del animal. Además es importante señalar que el animal transgénico no se ve perjudicado en su desarrollo porque el gen humano sólo se expresa en las células de las glándulas mamarias debido al regulador específico al que se le ha asociado y, por tanto, en las restantes células del animal no se sintetiza la proteína humana al estar silenciado el gen humano. En consecuencia, el animal doméstico ha sido convertido en un gran biorreactor sin perjuicio aparente para él.
Las primeras granjas farmacéuticas fueron establecidas por compañías biotecnológicas como Pharmaceutical Proteins Ltd (PPL) en Escocia (1500 ovejas), Genzyme Transgenics en Estados Unidos (1000 cabras), Gene Pharming Europe en Holanda (vacas), etc. Otros grupos de investigación son partidarios de la utilización de las granjas de cerdos transgénicos dado su corto tiempo de gestación (cuatro meses), el intervalo generacional (un año) y el mayor tamaño de las camadas (10 a 12 lechones), teniendo en cuenta además que una cerda lactante produce unos 300 litros de leche al año.
Las cifras económicas demuestran la importancia futura de las granjas farmacéuticas : el mercado de proteínas terapéuticas, que actualmente se obtienen principalmente mediante fermentación o cultivo celulares, se estima en unos 7.600 millones de dólares anuales y se calcula que podrá llegar a ser de 18.500 millones de dólares el año 2000.
Las cifras expresadas parecerían justificar las enormes inversiones que es necesario hacer para obtener animales transgénicos, tal como se indica en el cuadro adjunto:
Ovejas transgénicas
Los pacientes de enfisema hereditario necesitan ingerir grandes dosis de a -1-antitripsina para suplir su deficiencia en plasma, donde la concentración es de 2 mg/ml. Pues bien, en el Roslin Institute de Edinburgo, en colaboración con la empresa PPL, se han obtenido por diversos procedimientos ovejas transgénicas portadoras del gen humano que codifica para la a -1-antitripsina (unido al promotor de la b -lactoglobulina para que se exprese exclusivamente en las células de la glándula mamaria. Así, el grupo que dirige el Dr. Ian Wilmut microinyectaron 549 cigotos con el ADN del gen humano unido al promotor del gen de la b -lactoglobulina de oveja, obteniendo 113 individuos de los que cinco (un cordero y cuatro ovejas) eran transgénicos. Las ovejas producían más de 1 mg/ml de a -1-antitripsina en la leche e, incluso, una de ellas, que presentaba un mayor número de copias del transgén integradas en el genoma, llegó a producir hasta 63 mg/ml durante la primera semana, pero luego se estabilizó en 35 mg/ml (Wright et al., 1991).
El mismo grupo de investigación ha obtenido también ovejas transgénicas portadoras del gen humano que codifica para el factor IX de coagulación de la sangre (antihemofílico), primero mediante la técnica de microinyección en el pronúcleo del cigoto del correspondiente gen humano (ADNc) unido al promotor del gen de la b -lactoglobulina de la oveja (Clark et al., 1989) y más tarde mediante la técnica de clonación: transferencia de núcleos de fibroblastos fetales genéticamente modificados (Schnieke et al., 1997).
Cabras transgénicas
Las cabras también pueden constituir unos buenos biorreactores de proteínas humanas puesto que producen 4 litros/día de leche y sus períodos de gestación y de desarrollo son cortos (5 y 8 meses, respectivamente). Así, Ebert et al. (1991) obtuvieron cabras transgénicas portadoras del gen humano que codifica para el activador tisular de plasminógeno (AtPH) que, al estar unido al promotor del gen de la b -caseína de la cabra, producía hasta 2-3 mg/ml de AtPH en la leche del animal. La proteína podía ser aislada con una pureza del 98% y una actividad específica de 610.000 U/mg (Denman et al., 1991).
Vacas transgénicas
La gran producción lechera de las vacas (10.000 litros/año, 35 g proteína/litro de leche) las convierte en poderosos biorreactores de proteínas humanas. En 1991, tres grupos de investigación de Holanda (la Universidad de Leiden, la empresa Gene Pharming Europe y el Instituto de Producción Animal de Zeist) obtuvieron vacas transgénicas portadoras del gen humano de la lactoferrina que se sintetizaba en la leche del animal por estar unido al promotor de la a -S1-caseína bovina. Así, Krimpenfort et al. (1991) inyectaron 1.154 pronúcleos de otros tantos cigotos obtenidos por fecundación in vitro, de los cuales sobrevivieron 981.
A los 9 días transfirieron 129 embriones a vacas estimuladas hormonalmente (pseudopreñez), quedando 21 de ellas preñadas y sólo 16 llevaron a término la gestación. Se obtuvo un macho y una hembra (que era un mosaico). El macho dio positivo para la presencia del gen humano en todos los tejidos analizados (placenta, oreja y sangre), estimándose que era portador de 5 a 10 copias del gen humano.
Más tarde, otro grupo de investigación (Cibelli et al., 1998) obtuvo tres terneros clónicos transgénicos que llevaban el trasgén híbrido b -gal-neo que se expresaba con un promotor muy potente del citomegalovirus.
En el caso de las vacas, otros objetivos pueden ser la aplicación de la técnica conocida como "modelo de la glándula mamaria" para reducir la lactosa (para los casos de intolerancia) o fabricar "in vivo" leche maternizada, suprimiendo mediante la técnica de "knockout" del gen de la b -lactoglobulina de la leche de vaca para imitar a la leche humana que no la tiene.
XENOTRASPLANTES
Desde que el Doctor Christiaan Barnard hiciera su primer trasplante de corazón, la técnica de trasplante de órganos se ha generalizado en la práctica médica, habiendo alcanzado altísimos niveles de perfección. Sin embargo, uno de los retos pendientes es el de la oferta y la demanda: desgraciadamente muchos pacientes mueren antes de tener acceso al trasplante deseado. Por ello la posibilidad de recurrir a especies animales como donantes de órganos se planteó hace ya muchos años. De hecho, entre los años 1964 y 1995 se han realizado 32 xenotrasplantes de riñón, corazón, hígado y médula ósea procedentes mayoritariamente de chimpancé y mandril con un resultado negativo en todos los casos, tal como se indica en el cuadro adjunto:
La utilización de órganos procedentes de monos tenía la lógica de su proximidad evolutiva con la especie humana, pero la diferencia de tamaños de los órganos entre las especies suponía un serio inconveniente. Por eso se pensó en el cerdo como posible donante. Por otro lado, una causa importante del fracaso de los xenotrasplantes es el rechazo hiperagudo que se produce cuando el organismo humano reconoce la presencia del órgano de otra especie. De ahí surgió la idea de utilizar cerdos transgénicos como posibles donantes.
Respecto a la utilización de cerdos transgénicos como reservorio de órganos para posibles trasplantes (xenotrasplantes) de corazón, riñón o hígado a pacientes humanos hay que ser todavía muy cauto en relación con las expectativas creadas. El primer paso que se ha dado ha consistido en la obtención de cerdos transgénicos capaces de expresar el antígeno regulatorio del complemento humano, evitando así el rechazo hiperagudo (Dr. David J.G. White, en Cambridge, en 1992). No obstante, quedan por resolver aún numerosos interrogantes, entre ellos la posibilidad de que se transmitan al hombre infecciones virales de origen animal (Le Tissier et al. 1997). De ahí la importancia que tendría la posible utilización de cerdos transgénicos ante la demanda creciente de órganos y las correspondientes listas de espera. Para una revisión de los xenotrasplantes ver Lanza et al. (1997) y Cooper et al. (1997)
ASPECTOS BIOÉTICOS
En un contexto bioético quizá podría ser conveniente hacer una valoración general sobre lo que significa la introducción de genes humanos en organismos no humanos. Habría que distinguir dos situaciones diferentes: la primera, cuando la transferencia del gen humano al organismo no humano se hace en beneficio del propio hombre, y la segunda cuando la transferencia del gen humano al organismo no humano se hace exclusivamente en beneficio (o perjuicio) de este último.
Desde el punto de vista bioético, la situación creada por la obtención de mamíferos transgénicos portadores de genes humanos para la obtención de proteínas terapéuticas humanas no es esencialmente nueva ya que, desde los primeros tiempos de la ingeniería genética molecular, se han introducido genes humanos en células bacterianas para obtener proteínas humanas (insulina, hormona de crecimiento, interferón, etc.). Tanto en el caso de las bacterias como de los animales transgénicos que se convierten en factorías naturales (biorreactores) de proteínas humanas, la valoración ética es positiva. En este último caso es importante señalar además que, al quedar restringida la expresión del gen humano a las células de la glándula mamaria, la fisiología y desarrollo del animal no se ven alterados y por tanto se evita cualquier daño a éste, quedando protegidos así los derechos de los animales.
En el segundo caso planteado, cuando la transferencia del transgén humano se realiza con el único propósito de influir en el desarrollo del animal, la valoración ética puede ser negativa si se producen anomalías importantes en su fisiología, como ocurrió en los cerdos que habían incorporado el gen humano de la hormona del crecimiento. Finalmente, en este contexto ¿podría decirse que algún gen humano concreto - en definitiva, un trozo de ADN - merecería un tratamiento o valoración ética diferente al resto? La respuesta lógica sería negativa, so pena de caer en una sacralización del ADN humano.
¿Cuál es la valoración ética de los xenotrasplantes? En primer lugar, habría que tener la garantía suficiente de que no hay problemas de transmisión viral. Aún sentada esta premisa, hay que reconocer que a muchas personas les repugna, en principio, la idea de que alguien pueda llevar un órgano animal. Sin embargo habría que recordar que desde hace mucho tiempo se realiza la implantación de válvulas de cerdo a personas con ciertas insuficiencias cardiacas y todo el mundo ha aceptado esta práctica médica. Por otro lado, la existencia de prótesis de material inerte (plástico, metales, etc.) podría ser igualmente rechazado y no lo es. Ciertamente, desde el punto de vista ético parece que no habría razón para rechazar los xenotrasplantes en la medicina del futuro, siempre que se solucionen todos los aspectos técnicos - que son muchos - que aún quedan por resolver.
